Samoštúdium je nenahraditeľné

Prelomovým momentom v lekárskej genetike bolo osekvenovanie ľudského genómu v roku 2001. Odvtedy uplynulo už 18 rokov, počas ktorých sa genetici neúnavne snažili čoraz rýchlejšie a efektívnejšie hľadať genetické príčiny mnohých ochorení. To sa im dnes darí aj vďaka čoraz vyspelejšej technike. O nových možnostiach na poli genetiky sme sa rozprávali s RNDr. Renátou Zemjarovou Mezenskou, manažérkou Laboratória lekárskej genetiky Alpha medical na Poliankach v Bratislave.

Čo ste vyštudovali, ako ste sa dostali k práci v genetickom laboratóriu?

Vyštudovala som Prírodovedeckú fakultu UK v Bratislave, odbor molekulárna biológia a genetika. Už počas štúdia som inklinovala k humánnej genetike a na to bola zameraná aj moja diplomová práca, a v tomto bode som už smerovala k tomu, že sa budem venovať diagnostike dedičných chorôb. Po skončení školy som nastúpila do Fakultnej nemocnice v Bratislave, kde v roku 1995 docent Šimko s docentom Chandogom začali zriaďovať v rámci Centra lekárskej genetiky oddelenie molekulovej genetickej diagnostiky a oddelenie metabolických chorôb. Od roku 1996 som pôsobila v Centre lekárskej genetiky Fakultnej nemocnice v Bratislave. Počas tohto obdobia som spravila atestačnú skúšku z lekárskej genetiky na slovenskej postgraduálnej akadémii medicíny a neskôr som si urobila rigoróznu skúšku v študijnom odbore Biológia so špecializáciou lekárska genetika. Bolo to na Prírodovedeckej fakulte UK Bratislava.

Ako dlho pracujete v Alphe?

Odvtedy, keď Alpha kúpila spoločnosť Gendiagnostika, čo bolo v roku 2014. V roku 2004 som išla pracovať do spoločnosti Gendiagnostika ako jeden z prvých zamestnancov.

Za tieto roky už viete porovnávať. V čom vidíte najväčší posun v rámci genetickej diagnostiky?

Genetika ide dopredu veľmi rýchlym tempom. V priebehu pár rokov sa zmenilo mnoho. Jeden z mojich učiteľov, docent Ferák, na svojich prednáškach tiež hovorí, že po skončení prednášky už časť z učiva nie je pravdou – pokrok je taký rýchly. Najzásadnejší bol rok 2001, pretože práve vtedy sa osekvenoval ľudský genóm, čiže odvtedy sme schopní ho čítať a efektívne hľadať príčiny genetických chorôb. Sekvenovanie je čítanie usporiadania základných jednotiek DNA, ktorými sú adenín (A), guanín (G), cytozín (C) a tymín (T). V rámci diagnostiky hľadáme práve zmeny v ich usporiadaní, ktoré spôsobujú rôzne genetické ochorenia. V celej genetike je kľúčová aj rýchlosť získavania týchto informácií. Aj v tomto smere to ide neuveriteľným tempom. Nové prístroje, ktoré tu máme, nás o obrovský krok približujú k najvyššej úrovni genetickej diagnostiky v rámci celého sveta. Budúcnosť vidím v génovej terapii, ktorá je zameraná na využitie DNA na liečebné účely. Už existujú liečivá, ktoré sa v tejto oblasti používajú a v nasledujúcich rokoch azda budú pribúdať.

V čom spočíva génová terapia a v akom období života je najefektívnejšia?

Zjednodušene – ide o opravu génov, čiže ich modifikáciu. Bolo by super, ak by sa DNA každého človeka osekvenovala ihneď po narodení a vedelo by sa, na ktoré choroby má predispozície. Tie, ktoré sú liečiteľné, by mohli byť liečené od začiatku a ochorenie by sa týmto spôsobom nemuselo plne rozvinúť. U neliečiteľných si viem predstaviť minimálne ich oddialenie a zmiernenie dosahov chorôb na život človeka. Myslím, že v tomto spočíva budúcnosť genetiky.

Veľa sa dnes hovorí o paneloch genetických vyšetrení. Aký majú prínos pre prax a aká je história ich vzniku?

Panelové vyšetrovanie je revolučnou metódou v diagnostike genetických ochorení. Aj poisťovne postupne prichádzajú na to, že je pre ne výhodné, pretože je časovo aj finančné efektívne. Ak by sme mali v postupnosti vyšetrovať všetky gény, ktoré teoreticky môžu spôsobiť nejaké ochorenie, tak sa dostaneme vo finále na oveľa vyššiu sumu, ako keď vyšetríme jeden panel viacerých génov naraz. Pomocou panelového vyšetrenia môžeme uskutočniť analýzu veľkých génov, ktorá je pri klasickom Sangerovom sekvenovaní veľmi časovo náročná. Rovnako môžeme vyšetrovať aj polygénové ochorenia, alebo tie, ktoré sa klinicky prekrývajú. Niektoré typy NGS (Next-generation Sequencing, pozn. red) prístrojov prinášajú aj možnosť neinvazívneho prenatálneho testovania, čiže NIPT. Zavedenie masívneho paralelného sekvenovania ľudského genómu napomohlo ku získaniu rádovo tisícov až miliónov báz naraz a tieto môžeme následne analyzovať.

Ako sa vám darí presadiť tieto vyšetrenia v poisťovniach?

Poisťovanie sú po rokovaniami s nami tiež prístupnejšie možnosti masívneho sekvenovania. Niektoré však majú podmienku, že vyšetrenie musí byť urobené na Slovensku a to bolo aj jedným z podnetov k tomu, aby sme kúpili nové prístrojové vybavenie. V súčasnosti niektoré vyšetrenia posielame do spolupracujúceho laboratória spoločnosti CGC v Porte, ktoré je tiež súčasťou skupiny Unilabs. Má dlhoročné skúsenosti a portfólio vyšetrení, ktoré poskytuje, je veľmi široké. Táto spolupráca nás teší, pretože otvára slovenským lekárom aj pacientom dvere k širšej ponuke vyšetrení.

Prezraďte nám príklady konkrétnych panelových vyšetrení, ktoré budú v ponuke.

Bude sem patriť analýza zriedkavých ochorení – napríklad rôzne polyneuropatie, ochorenia spojivového tkaniva, muskulárne dystrofie, dedičné formy ataxií, autizmus, kardiomyopatie či rasopatie. Toto sú niektoré z najčastejších požiadaviek na diagnostiku, ktoré nám chodia. Tie zohľadníme v portfóliu ponúkaných vyšetrení.

Doteraz tieto vyšetrenia nebolo možné vykonávať?

Bolo to možné vďaka spolupráci s pracoviskom v Porte, kam sme vzorky posielali. Teraz už vyšetrenia budeme môcť vykonávať aj priamo u nás. Ale systém posielania vzoriek stále využívať budeme, pretože všade na svete je to štandard – nie každé laboratórium môže vyšetrovať všetko. Niektoré vyšetrenia sú veľmi zriedkavé a práve preto sa využíva tento model – je efektívny aj úsporný. Je však našou snahou čo najviac vyšetrení vykonávať priamo v našich laboratóriách. Je to dlhodobý proces.

Ako prebieha cesta k výsledku pomocou stroja NGS?

Masívnym paralelným sekvenovaním (Next-generation Sequencing, NGS, pozn. red) sa získa kopec dát, ktoré treba potom analyzovať a spracovávať, kým vyjde finálna verzia výsledku. Pozitívne nálezy, ktoré nájdeme, treba overiť druhou nezávislou metódou – takzvaným Sangerovým sekvenovaním, ktoré uskutočňujeme priamo u nás, v rutinnej praxi. Toto vyšetrenie teda nie je také automatické ako napríklad vyšetrenia na biochémii, kde sa krv vloží do stroja a ten vydá výsledok. My hľadáme zmeny, ktoré by mohli spôsobovať samotné ochorenie pacienta. Keď objavíme zmenu, tak v medzinárodných databázach hľadáme, či už tieto varianty boli opísané ako kauzálne v súvislosti s daným ochorením, alebo sú to varianty s neznámou klinickou signifikanciou. Prípadne sú to benígne varianty, ktoré na klinický stav nemajú vplyv. Je to pomerne zložitá práca, ktorú musí vykonávať vysokoškolsky vzdelaný genetik.

Koľko takých genetikov máte v bratislavskom laboratóriu a ako vyzerá váš tím?

Najviac tu máme vysokoškolsky vzdelaných genetikov – laboratórnych diagnostikov. Je nás tu 8. Okrem toho máme 2 administratívne sily a 2 laborantky, z ktorých každá má na starosti inú činnosť. Jedna robí príjem vzoriek a izoláciu DNA a druhá je laborantka, ktorá je schopná previesť všetky sekvenácie génov a analýzy až po niektoré hodnotenia. Navzájom sa však vieme zastúpiť, pretože princíp vyšetrovania je v podstate rovnaký.

Ako spoznáme dobrého genetika? A aké vlastnosti by mal mať šikovný laboratórny diagnostik?

Najmä tak, že je jedným z mála. (smiech) Dobrých genetikov je akútny nedostatok. Veľmi dôležité sú skúsenosti, to platí zrejme vo všeobecnosti. U genetika je kľúčová vôľa neustále sa vzdelávať a študovať. Genetika ide neustále dopredu a vo veľmi vysokom tempe. Pri vyhodnotení každého pacienta porovnávame dáta (zmeny) s medzinárodnými databázami a hľadáme kauzalitu nájdených variantov. Pozeráme na publikácie a porovnávame nálezy. Ide teda o neustále čítanie publikácií a najnovších poznatkov. Samoštúdium je nenahraditeľné. Najdôležitejšou vlastnosťou dobrého laboratórneho diagnostika je precíznosť a presnosť. Tá sa ukáže najmä pri pipetovaní, pretože sa tu miešajú mikromnožstvá.

Dobrých genetikov je akútny nedostatok. Veľmi dôležité sú skúsenosti, to platí zrejme vo všeobecnosti. U genetika je kľúčová vôľa neustále sa vzdelávať a študovať.

Ako dlho genetické vyšetrenia v súčasnosti trvajú?

Doba, za ktorú dospejeme k výsledku, závisí od toho, aký veľký gén sa analyzuje. Ak analyzujeme menší gén, trvá to približne do 2-3 týždňov. Keď ide o tehotnú pacientku, alebo pacienta, ktorý čaká na operáciu, tak sa snažíme dobu čo najviac skrátiť. Ak ide o varianty, ktoré už boli v rámci danej rodiny zistené, vieme výsledok spracovať približne do týždňa. Rovnako, keď vyšetrujeme plodovú vodu, najčastejšie trizómie chromozómov – 13, 21, 18, tak robíme rýchly test na detekciu trizómií. Vďaka nemu vieme dodať výsledok na tretí pracovný deň od odberu. Ak je gén veľký, alebo vyšetrujeme viacero génov, kompletná analýza môže trvať aj mesiac. Panelové vyšetrenia môžu trvať aj niekoľko mesiacov. Napríklad v Porte je stanovený TAT (turn-around time, pozn. red.) na 2 mesiace. Naším cieľom je neustále znižovať čakaciu dobu. Naše laboratóriá majú skutočné široké portfólium testov a preto k nám chodí veľmi veľký objem vyšetrení. Neustále vylepšujeme techniku aj systém práce tak, aby sme boli čo najefektívnejší. Urgentné prípady majú, samozrejme, prednosť. Nové prístroje nás môžu v tomto smere posúnúť výrazne vpred.

Povedzte nám o nich viac.

Nové prístroje sú tu zhruba dva týždne (v čase rozhovoru, pozn. red.), už k nim prebehlo aj školenie. Sú to dva stroje – iSeq 100 a NextSeq 550. Každý z nich má trošku iné využitie. NextSeq dokáže sekvenovať 30 – 120 gigabáz naraz, čo dáva asi 400 miliónov čítaní, ktoré vieme prečítať. Celkový čas sekvenovania je 12 až 30 hodín. iSeq dokáže na jeden run osekvenovať 1,2 gigabázy, čo dáva 4 milióny čítaní a celkový čas sekvenovania je 9 – 17 hodín. Tento menší prístroj chceme využívať na sekvenovanie menších panelov alebo jednotlivých génov, ktoré sú veľmi veľké a ich klasická sekvenácia by bola príliš časovo náročná. Čo sa týka stroja NextSeq, na ňom chceme sekvenovať väčšie génové panely.

Keď porovnáte staršie prístroje s novými, v čom nastane najvýraznejší pokrok?

Na starších strojoch môžeme pomocou Sangerovho sekvenovania uskutočňovať analýzu monogénových ochorení, menších génov. V rámci novšieho sekvenovania, čiže NGS, vieme sekvenovať veľké gény a polygénové ochorenia, klinicky sa prekrývajúce ochorenia a vieme analyzovať viac génov naraz. Čiže napríklad vyšetrenie 5 génov, ktoré by postupne pokryli staré stroje, uskutoční nový stroj v jednom procese.

Do akej miery sú vyšetrenia realizované automaticky?

Pri každom vyšetrení je nevyhnutná účasť človeka. Už len príprava NGS knižníc, ktoré vkladáme do stroja, vyžaduje človeka. Až finálna analýza prebieha v stroji. A potom, samozrejme, analýzu všetkých dát zo strojov musí urobiť človek. Buď je to spolupráca genetika a bioinformatika, alebo je to práca genetika v kombinácii s vyhodnocovacím softvérom, z ktorého ťaháme klinicky relevantné dáta. Nič nie možné uskutočniť úplne automaticky. V genetike to funguje iba čo sa týka rutinnej diagnostiky. V súčasnosti už používame CIVD kity, najčastejšie typu ready to use, čiže sa napipetuje master mix, k tomu sa pridá DNA, a hodí sa to do stroja, ktorý dá finálny výsledok. Tu patria napríklad trombofilné mutácie, hereditárna hematochromatóza, Wilsonova choroba, Gilbertov syndróm, celiakia, laktózová a fruktózová intolerancia, a podobne. To sú relatívne jednoduché vyšetrenia, avšak validáciu musí vždy vykonať odborník, ktorý z prístrojov odčítava krivky a definuje výsledok. Sú tri možnosti výsledku – homozygot pre wild type alelu, homozygot pre mutantnú alelu alebo heterozygot, čiže prenášač. Finálne závery je možné prepojiť s naším informačným systémom.

Bude možné tieto procesy v budúcnosti absolútne zautomatizovať?

Myslím, že áno. Už o tom kolegovia v Banskej Bystrici s naším IT oddelením aj komunikujú.

Aké novinky v genetických testoch momentálne Alpha ponúka?

Najnovším testom je Tomorrow, čiže neinvazívny prenatálny test, skrátene NIPT, ktorý dokáže odhaliť chromozomálne aberácie plodu. V súčasnosti slúži ako skríningový nástroj pri diagnostike najznámejších autozómových alebo gonozómových anomálií. Izoluje sa cirkulujúca DNA plodu z krvi matky a osekvenuje sa s cieľom detekcie najčastejších aneuploidií chromozómov 13, 18 a 21 a pohlavných chromozómov X a Y. V prípade pozitívneho nálezu musí byť tento test vždy konfirmovaný prostredníctvom vyšetrenia plodovej vody alebo choriových klkov. Tento typ testu sa dá komplexne vyšetrovať v prípade jednoplodových tehotenstiev, pri viacplodových tehotenstvách sa dá určiť iba prítomnosť alebo neprítomnosť Y chromozómu. Výsledok môže byť ovplyvnený napríklad nedávnou transfúziou krvi alebo transplantáciou, potom v prípade takzvaného miznúceho plodu, prípadne ak je prítomný placentárny mozaicizmus alebo chromozomálny mozaicizmus. Test je možné uskutočniť od 10. týždňa tehotenstva. Tomorrow je výborným nástrojom na to, aby sa budúca matka mohla rozhodnúť, či podstúpi invazívne vyšetrenie, alebo nie. Vyšetrenie indikuje gynekológ a momentálne ho posielame do spolupracujúceho laboratória spoločnosti CGC v Porte. Momentálne ho poskytujeme iba v samoplatcovskom režime, nie je hradený zo zdravotného poistenia.

Prečo test neuskutočňujeme na Slovensku?

Na jeho uskutočnenie je nutný NGS sekvenátor, ktorý sme doteraz nemali. Avšak spolupráca s Portom je založená najmä na expertíze miestneho pracoviska, ktoré má na svojom konte bohaté skúsenosti s týmto textom a zrealizované vysoké objemy. Čiže je zabezpečená efektívnosť z časového hľadiska aj z hľadiska úrovne kvality prevedenia testu. Samozrejme, po tom, ako sme nakúpili nové stroje, je možnosť, že v budúcnosti začneme tento test robiť aj priamo u nás.

Aké ďalšie vyšetrenie ponúkame v rámci noviniek?

V súčasnosti do nášho portfólia pribudlo ďalšie vyšetrenie bunkovej a protilátkovej imunity – takzvaný TREC | KREC test. Je to skríningové vyšetrenie vrodenej poruchy imunity najmä u detí ihneď po narodení. Keďže deti sú istý čas po narodení ešte chránené imunitnými mechanizmami od matky, táto porucha by sa nemusela počas daného obdobia prejaviť. Na jej včasnú identifikáciu slúži práve test TREC | KREC. Ide o modernú neinvazívnu real-time PCR metódu, pričom vyšetrenie sa uskutočňuje najčastejšie zo suchej kvapky krvi.

Aké vyšetrenia sú v našich genetických laboratóriách najčastejšie?

Najpočetnejšie sú určite vyšetrenia rutinnej diagnostiky. Sem patria bežné poruchy zrážanlivosti krvi, hereditárna hematochromatóza a podobne. Je to približne 500 – 600 vzoriek za týždeň, čiže zhruba 1500 – 1800 vyšetrení mesačne. V oblasti zriedkavých ochorení máme početné vyšetrenie týkajúce sa somatických mutácií z nádorovej DNA, ktoré robia naše kolegyne v Košiciach. Okrem toho treba uviesť, že plánované panelové vyšetrenia sme navrhli práve na základe najčastejších požiadaviek od lekárov.

Ako sa uplatňujú genetické vyšetrenia v rámci prevencie?

Prevencia je založená aj na skríningu chorôb s genetickým rizikom, pretože každý človek sa narodí s určitou genetickou výbavou, ktorú nevieme zmeniť. Máme predispozíciu na niektoré choroby. Napríklad, ak sa v konkrétnej rodine sa vyskytuje viac kardio-vaskulárnych ochorení, prípadne karcinómov, tak je tam šanca, že aj ďalší potomkovia budú mať zvýšené riziko týchto ochorení. V týchto prípadoch sú pacienti odoslaní do genetických ambulancií, v ktorých lekári s nimi robia rodokmeňové analýzy a zisťujú, ktorí členovia rodiny trpeli konkrétnym ochorením. Na základe dedičnosti následne vyrátajú, v akom riziku je pacient. Potom máme iný prípad, ak už je nejaký člen rodiny postihnutý ochorením, tak v rámci segregačnej analýzy sa vyšetrujú ďalší členovia rodiny, aby sme vedeli určiť, ktorí a do akej miery sú ochorením ohrození. Tieto analýzy sú významným podkladom pre účinnú prevenciu. Úlohou genetiky je spoznať chorobu, ktorú má pacient a zistiť, aká zmena v géne spôsobila ochorenie a v neposlednom rade aj liečiť chorobu. Problémom ostáva, že väčšina genetických ochorení sa nedá liečiť. Vieme však predpovedať prognózu pre pacienta, prípadne možnosť ďalšieho výskytu ochorenia v rodine a to má významný vplyv na zavedenie účinných preventívnych opatrení, napríklad v životnom štýle ohrozeného jedinca.

Prevencia je založená aj na skríningu chorôb s genetickým rizikom, pretože každý človek sa narodí s určitou genetickou výbavou, ktorú nevieme zmeniť. Máme predispozíciu na niektoré choroby.

Koľko členov rodiny ste najviac vyšetrili v rámci diagnostiky výskytu ochorenia?

Nedávno jedna kolegyňa mala rodinu, v ktorej sa u jedného člena zistil určitý variant a v rámci segregačnej analýzy jej poslali ďalších 5-6 príbuzných. Niekedy je ťažké prizvať všetkých, pretože z rôznych dôvodov nemôžu alebo nechcú prísť. Niektorí ľudia dokonca tieto vyšetrenia odmietajú a nechcú vedieť, či sú v riziku, majú strach. Iní zase neprikladajú ochoreniu význam. Pre lekára to nie je priaznivé, pretože on má záujem v rámci komplexnosti vyšetriť čo najširšie spektrum členov rodiny.

Čo si myslíte o domácich kitoch na genetické testovanie, napríklad s cieľom identifikovať rodové línie svojich predkov?

Je to viac-menej komerčná záležitosť, napríklad takzvané DNA dedičstvo, vďaka ktorému údajne človek môže zistiť svoj etnický pôvod, odkiaľ pochádza. Prípadne nájsť najbližších možných príbuzných, o ktorých človek nevie. Viem, že sa takto robia aj rodokmene. Poskytovatelia zrejme majú širokú databázu, s ktorou pracujú, možno majú rôzne záznamy zo sčítania ľudí, prípadne genealogické zdroje. Ide o jednoduchý test, ktorý sa vykonáva zo steru z bukálnej sliznice. Čo sa týka relevantnosti, s reálnou genetickou diagnostikou to nemá veľa spoločného.

Zavedenie panelových vyšetrení je zásadný krok vpred a cítime potrebu efektívne o tom informovať najmä lekárov, ktorí vďaka týmto vyšetreniam môžu poskytnúť pacientovi ešte lepšiu pomoc a reálne vyriešiť mnohé zdravotné problémy.

Nedávno ste prešli akreditačným dohľadom. V akom zmysle sa zmenila akreditácia a v čom je to prospešné pre klientov?

Zmenili sme typ akreditácie. Predtým sme mali takzvaný fixný rozsah a prešli sme na flexibilný rozsah. To znamená, že predtým sme mali akreditované konkrétne ochorenia, čo sa týka rutinnej diagnostiky, a teraz máme akreditované metódy používané v našich laboratóriách. Umožňuje nám to prevziať zodpovednosť za riadenie rozsahu akreditácie, čiže pridávať ochorenia, ktoré akreditovanou metódou vyšetrujeme. Sú tam, samozrejme, určené aj hranice, v rámci ktorých je táto akreditácia flexibilná. Benefit pre klienta spočíva najmä v tom, že portfólio akreditovaných vyšetrení je omnoho širšie. V súčasnosti sa už aj zdravotné poisťovne prikláňajú k tomuto systému.

Čo vás najviac baví na vašej práci?

To, že vieme pomôcť pacientom nájsť príčinu problému, ktorý majú. Samozrejme, nie vždy sa nám to podarí, pretože je veľa ochorení, ktoré sú polygénne, multifaktoriálne a nájdenie príčiny týchto ochorení je veľmi zložité a časovo náročné. Dôležitá je spolupráca klinického genetika a diagnostikov v laboratóriu. Na základe požiadavky klinických genetikov vyšetrujeme gény, ktoré môžu byť zodpovedné za ochorenia a často ľuďom reálne pomôžeme.

Aké sú vaše ciele do budúcnosti?

Našou hlavnou úlohou v blízkej budúcnosti je klásť väčší dôraz na to, aby sme sa častejšie a lepšie prezentovali odbornej verejnosti. Vďaka nákupu nových strojov naozaj máme čo ponúknuť a radi by sme to dali vedieť prostredníctvom účasti na rôznych konferenciách, kongresoch či klinických dňoch. Zavedenie panelových vyšetrení je zásadný krok vpred a cítime potrebu efektívne o tom informovať najmä lekárov, ktorí vďaka týmto vyšetreniam môžu poskytnúť pacientovi ešte lepšiu pomoc a reálne vyriešiť mnohé zdravotné problémy. Radi by sme informovali najmä neurológov, kardiológov či pediatrov. Našim cieľom je teda zvýšiť povedomie o dostupnosti nových testov a technológií. 

foto: Ladislav Rybár                                        

Hodnotenie článku

inVitro 2/2019

Adynamia, slabosť a únava

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 2/2019 Adynamia, slabosť a únava. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro