Antierytrocytové protilátky a transfúzne komplikácie

Skríning a prípadná špecifikácia antierytrocytových protilátok sú súčasťou každého predtransfúzneho vyšetrenia. U pacientov so zápalovými a autoimunitnými ochoreniami je riziko aloimunizácie 3-násobne vyššie. Identifikácia aloprotilátok pri reumatologických ochoreniach je často komplikovaná nálezom autoprotilátok, ktoré patria k ich relatívne bežnému laboratórnemu obrazu.

Úvod

Antierytrocytové protilátky sa nachádzajú v sére 0,1 až 0,3 % zdravých darcov krvi. U pacientov po opakovanej transfúznej liečbe je ich frekvencia výskytu 2 až 6 %. Detekcia a identifikácia antierytrocytových protilátok je nevyhnutná pre správny výber erytrocytových transfúznych prípravkov. Podanie inkompatibilnej krvi môže spôsobiť akútnu alebo oneskorenú hemolytickú potransfúznu reakciu. Reálna incidencia akútnej hemolytickej potransfúznej reakcie nie je známa. Historické štúdie ju odhadujú na 1 : 10 000 až 1 : 50 000 podaných erytrocytových transfúzií, niektoré novšie práce na 1 : 300 000. Incidencia oneskorenej hemolytickej potransfúznej reakcie je podľa prehľadu z Mayo kliniky 1 : 9 094 podaných erytrocytových transfúzií (0,01 %). V USA v rokoch 2008 – 2012 zomrelo na následky hemolytickej potransfúznej reakcie 53 ľudí. Skvalitnenie hemovigilancie snáď poskytne relevantnejšie štatistické informácie. Príčinou týchto nepresných a skreslených dát sú nedostatky v hlásení potransfúznych reakcií (2). Ďalšou oneskorenou potransfúznou komplikáciou je aloimunizácia proti antigénom erytrocytov. Riziko aloimunizácie závisí od viacerých faktorov. Jedným z nich je základné ochorenie pacienta. Pri niektorých diagnózach je pravdepodobnosť tvorby aloprotilátok podstatne vyššia: pri myelodysplastickom syndróme 21 – 58,6 %, pri hemoglobinopatiách 29 %, pri ťažkej renálnej insuficiencii 14 %, pri aplastickej anémii 11 %. Ďalším faktorom je imunogenicita konkrétneho antigénu. Tá je najvyššia s výnimkou krvnej skupiny AB0 pri Rh antigénoch c, E, C a antigéne K (4, 6).

Etiológia

Antierytrocytové protilátky sú imunoglobulíny triedy IgG a IgM, zriedka IgA, ktoré sú namierené proti niektorému z antigénov erytrocytov. V súčasnosti je ich známych viac než 340. Protilátky sa členia na prirodzené pravidelné a imúnne. Prirodzené pravidelné vznikajú bez imunizácie, sú triedy IgM, sem patria protilátky v systéme AB0. Protilátky, ktoré sa tvoria až po imunizácii (transfúznou alebo transplantačnou liečbou, počas gravidity), sú označované ako nepravidelné imúnne. Bývajú triedy IgG, aj keď vo včasnej fáze imunitnej odpovede dochádza prvotne k tvorbe IgM. Funkciou protilátky je odstraňovanie „cudzieho“ z vlastného organizmu. V prípade deštrukcie transfundovaných erytrocytov s naviazanou protilátkou sa uplatňuje aktivácia komplementu spôsobujúca buď intravaskulárnu, alebo extravaskulárnu hemolýzu, prípadne sa uplatní fagocytóza erytrocytov bunkami monocyto-makrofágového systému s následnou extravaskulárnou hemolýzou.

Tabuľka č. 1: Klinický význam antierytrocytových protilátok a výber transfúzneho prípravku (7, 9)

Nie všetky antierytrocytové protilátky sú klinicky významné. Za klinicky významné sa považujú len tie, ktoré spôsobia signifikantnú deštrukciu transfundovaných erytrocytov nesúcich korešpondujúci antigén (Tabuľka č. 1). Patria k nim – okrem anti-A, anti-B, anti-A, B – tie protilátky, ktoré reagujú v nepriamom antiglobulínovom teste pri 37 °C (NAT), preto sa NAT využíva pri ich skríningu a identifikácii (1).

Diagnostika

Prirodzené protilátky anti-A, anti-B a anti-A, B sa stanovia v rámci vyšetrenia krvnej skupiny AB0 s použitím diagnostických erytrocytov A1 a B. Pre správnu interpretáciu výslednej AB0 skupiny sa súčasne vyšetria antigény erytrocytov A a B s monoklonálnymi diagnostikami anti-A a anti-B (Tabuľka č. 2).

Tabuľka č. 2: Vyšetrenie krvnej skupiny AB0
Obrázok č. 1: Princíp nepriameho antiglobulínového testu (NAT). V prvej fáze testu sa počas inkubácie pri 37 °C naviaže na erytrocyty nesúce určitý antigén protilátka IgG zo séra/plazmy, ktorá je namierená proti tomuto antigénu. Aglutinácia obvykle nenastane, a preto sa na dôkaz naviazania protilátky na erytrocyty pridá do reakcie Coombsove sérum (štandardne anti-IgG + C3d), ktoré ju umožní.

Na detekciu nepravidelných protilátok v sére/plazme pacienta sa v súčasnosti používa skríningové vyšetrenie nepriamym antiglobulínovým testom (Obrázok č. 1) s použitím minimálne 3 diagnostických erytrocytov s definovaným fenotypom. Využíva sa metóda stĺpcovej aglutinácie (Obrázok č. 2) alebo pevnej fázy (Obrázok č. 3) – manuálne alebo na automatických krvinkových analyzátoroch. Diagnostické erytrocyty musia mať vo fenotype zastúpené antigény: C, Cw, c, D, E, e, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, M, N, Lea; v homozygotnom zastúpení Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s; minimálne jedny skríningové erytrocyty majú fenotyp R1R1 (DCe/DCe) alebo R1wR1 a jedny fenotyp R2R2 ( DcE/DcE) (Brguig). Tento test je dnes neoddeliteľnou súčasťou vyšetrenia krvnej skupiny AB0 a RhD a každého predtransfúzneho vyšetrenia (1, 7, 9).

Obrázok č. 2: Skríning protilátok NAT – stĺpcová aglutinácia (3). Mikroskúmavka obsahuje gélový matrix s Coombsovým sérom. Do mikroskúmavky sa kvapne suspenzia diagnostických erytrocytov v modifikovanom LISS roztoku (roztok s nízkou iónovou silou) s určitou koncentráciou a následne sérum/plazma pacienta. Po 15 min. inkubácie pri 37 °C a po následnej centrifugácii sa odčítava výsledok reakcie. Ak sérum/plazma obsahuje protilátku, erytrocyty po jej naviazaní nemohli počas centrifugácie zostúpiť cez gélový matrix na dno mikroskúmavky a zostávajú v jej hornej časti. V prípade neprítomnosti protilátky sú diagnostické erytrocyty uložené na dne mikroskúmavky. Sila reakcie sa odčítava na +. Výsledok má podobu -, -/+, +, ++, +++, ++++.

Obrázok č. 3: Skríning protilátok NAT – pevná fáza (3). Diagnostické erytrocyty sú fixované na dne jamiek mikrotitračnej platničky. K nim sa prikvapne sérum/plazma pacienta. Po inkubácii sa do reakcie pridajú erytrocyty senzibilizované IgG protilátkou. Nasleduje centrifugácia a odčítanie typu reakcie. V prípade, že sérum/plazma obsahuje protilátku, tá sa naviaže na diagnostické erytrocyty a následne sa na túto protilátku v tenkej vrstve naviažu indikátorové erytrocyty na celom povrchu jamky. Ak sérum/plazma neobsahuje žiadnu protilátku, indikátorové krvinky sa nemajú na čo naviazať a zostávajú sústredené na dne jamky platničky.

V prípade plánovanej hemoterapie sa doplňuje skríning protilátok testom kompatibility, ktorý sa realizuje rovnakou metódou ako skríning protilátok a v reakcii sa použijú erytrocyty transfúzneho prípravku a sérum/plazma pacienta.

Tabuľka č. 3: Príklad identifikácie antierytrocytovej aloprotilátky anti-E (zelenou sú vyznačené antigény, ktoré pacient nemá vo fenotype, červenou diagnostické erytrocyty reagujúce s protilátkou)

Pri pozitívnom výsledku skríningu sa pristupuje k špecifikácii protilátky s panelom minimálne 8 diagnostických erytrocytov so známym fenotypom. Minimálne jedny diagnostické erytrocyty majú fenotyp R1R1, R1wR1, R2R2, r´r (Cde/cde) a r´´r (cde/cdE), minimálne dve majú antigén K, k, Fya, Fyb , Jka , Jkb, S, s; najmenej jedny sú s fenotypom k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, S, s v homozygotnom zastúpení; najmenej tri majú fenotyp rr (cde/cde) a súčasne jedny antigén K a jedny z nich majú homozygotné zastúpenie k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, S, s. Tento panel sa použije pri hodnotení reaktivity séra/plazmy pacienta v NAT a obvykle v enzýmovom teste (7). Enzýmy (bromelín, papaín) dokážu modifikovať proteíny, ktoré nesú niektoré antigény erytrocytov tak, že ich reaktivita s protilátkou sa buď zosilňuje, alebo naopak zaniká. Okrem týchto základných postupov sa pri špecifikácii zmesi antierytrocytových protilátok využívajú ďalšie špeciálne techniky (Tabuľka č. 4) (5, 8). V bežnej praxi najčastejšie vyšetrenými aloprotilátkami sú anti-M, anti-E, anti-c, anti-D, anti-C, anti-Le.

Tabuľka č. 4: Špeciálne techniky identifikácie antierytrocytových aloprotilátok (5, 8)

Súčasne sa vyšetrí autokontrolný test, to znamená test reaktivity vlastných erytrocytov s vlastným sérom pacienta a priamy antiglobulínový test na odlíšenie prítomnosti autoprotilátky. Pri identifikácii protilátky napomáha vyšetrenie fenotypu vlastných erytrocytov pacienta, pretože aloprotilátka môže byť namierená len proti antigénom, ktoré pacient nemá. Fenotyp sa stanovuje s použitím monoklonálnych a polyklonálnych diagnostík namierených proti jednotlivým antigénom erytrocytov buď skúmavkovo, metódou stĺpcovej aglutinácie alebo pevnej fázy manuálne, alebo na automatických krvinkových analyzátoroch. Pri použití monoklonálnych diagnostík sa k erytrocytom pacienta pridá konkrétne monoklonálne diagnostikum a hodnotí sa priamo aglutinácia, v prípade polyklonálnych diagnostík (napríklad anti-Fya, anti-Fyb) sa pri vyšetrení využíva princíp nepriameho antiglobulínového testu. Treba upozorniť, že vyšetrenie fenotypu pacienta má význam len v prípade, ak posledné 3 mesiace nedostával transfúzie erytrocytov. Ak transfúzie posledné 3 mesiace dostával, v takom prípade treba realizovať vyšetrenie genotypu erytrocytových antigénov. Toto vyšetrenie, bohužiaľ, nie je na Slovensku dos­tupné. Ak sa u pacienta identifikuje antierytrocytová protilátka, pacientovi sa vystaví protilátkový preukaz, ktorý musí nosiť stále so sebou (9).

Potransfúzne hemolytické reakcie

V prípade, že sa pri predtransfúznom vyšetrení nepodarí zachytiť protilátku (v dôsledku chyby pri vyšetrení, v dôsledku veľmi slabej reaktivity alebo kvôli oslabeniu protilátky pod detekčné možnosti dostupnej metodiky), hrozí pri podaní inkompatibilnej krvi riziko potransfúznej hemolytickej reakcie. Akútna hemolytická potransfúzna reakcia má dramatický priebeh a zvyčajne je spôsobená podaním AB0 inkompatibilnej krvi v dôsledku administratívnej chyby a nedodržania povinného postupu pri podávaní transfúznej liečby. Oneskorená hemolytická potransfúzna reakcia je na­opak často spôsobená protilátkami, ktoré v čase predtransfúzneho vyšetrenia nebolo možné zachytiť a po podaní inkompatibilnej krvi nastáva v priebehu niekoľkých dní booster efekt, pamäťová imunitná odpoveď. Jej dôsledkom je generovanie aloprotilátky, ktorá spôsobí výrazné skrátenie prežívania transfundovaných erytrocytov sprevádzané klinickými príznakmi uvedenými v Tabuľke č. 5 (2, 4).

Tabuľka č. 5: Hemolytická potransfúzna reakcia

Pri známkach potransfúznej reakcie u pacienta treba okrem okamžitého prerušenia hemoterapie, klinického vyšetrenia a základných liečebných úkonov vykonať aj laboratórne testy, a to v čo najkratšom čase. Na vyšetrenie potransfúznej reakcie treba krv pacienta na overenie výsledkov ABO a RhD krvnej skupiny, skríning protilátok a test kompatibility. Doplní sa priamy antiglobulínový test (PAT), ktorý slúži na potvrdenie naviazania protilátky na transfundované erytrocyty. K erytrocytom vzorky pacienta sa pridá Coombsovo (obvykle anti-IgG + C3d) sérum. Ak je protilátka naviazaná na transfundované erytrocyty, Coombsovo sérum spôsobí aglutináciu. Pri pozitivite PAT sa pripraví eluát. Špecifickými fyzikálno-chemickými metódami (v dnešnej dobe sa najčastejšie využíva kyslý elučný test) sa dosiahne uvoľnenie protilátky z erytrocytov do eluátu, ktorý sa potom použije na identifikáciu aloprotilátky podobne ako sérum/plazma pacienta. Súčasne sa zopakujú všetky testy z pôvodnej vzorky odoslanej do krvnej banky a z transfúznych vakov krvných prípravkov. Ak bol PAT pozitívny aj vo vzorke pred podaním transfúzie, treba pátrať po inej možnej príčine (lieky, autoimunitný proces atď.).

Tabuľka č. 6: Laboratórne vyšetrenia pri podozrení na hemolytickú potransfúznu reakciu

V prípade podozrenia na hemolytickú potransfúznu reakciu sa vyšetrí krvný obraz pacienta vrátane počtu retikulocytov, základná hemokoagulácia za účelom vylúčenia diseminovanej intravaskulárnej hemokoagulácie a vykoná sa biochemické vyšetrenie krvi a moču zamerané na potvrdenie hemolytického procesu a známok renálnej insuficiencie (1, 4). Hlásenie nežiaducich potransfúznych reakcií sa vykonáva v súlade s platnou slovenskou legislatívou (10).

Problematika aloimunizácie presahuje rozsah tohto príspevku. Treba však zdôrazniť, že v indikovaných prípadoch – to znamená u pacientov s perspektívou polytransfúznej liečby, v transplantačnom programe, u pacientov so známou aloprotilátkou a pri autoimunitnej hemolytickej anémii – je potrebné vyšetrenie kompletného fenotypu erytrocytov pacienta a minimálne podávanie ABO, Rh a K fenotypovo kompatibilných erytrocytových transfúznych prípravkov.

Záver

Správne predtransfúzne imunohematologické vyšetrenie realizované vhodnou a citlivou metódou je kľúčové v prevencii potransfúznych hemolytických reakcií. U polytransfundovaných pacientov sa navyšuje riziko aloimunizácie, a preto je hlavne v spojitosti s niektorými diagnózami na mieste otázka vyšetrenia kompletného fenotypu erytrocytov pred zahájením hemoterapie.


Literatúra

  1. AABB(2011). Standards for Blood Banks and Transfusion Services. 27th ed. Bethesda MD:AABB 2011.
  2. Bolton HB, Cohen H. Serious Hazards of Transfusion (SHOT) haemovigilance and progress is improving transfusion safety. British Journal of Haematology 2013; 163:303-314.
  3. Daniels G, Bromilow, I. Essential Guide to Blood Groups. 3rd ed. Malden: Blackwell Publishing 2013.
  4. Hillyer CD, Silberstein LE, Ness PM, Anderson KC, Roback JD. Blood Banking and Transfusion Medicine: Basic Principles and Practice. 2nd ed. Philadelphia, PA: Churchill Livingstone Elsevier 2006.
  5. Klein HG, Anstee DJ. Mollisons Blood Transfusion in Clinical Medicine 11th ed. Maryland: Blackwell Publishing 2005.
  6. Kormoczi GF. Responder Individuality in Red Blood Cell Alloimunisation. Transfus Med Hemother 2014; 41:446 – 451.
  7. Milkins C, Berryman J, Cantwell C, Elliott C, Haggas R, Jones J, Rowley M, William M. Guidelines for pre-transfusion compatibility procedures in blood transfusion laboratories. Transfusion Medicine 2013; 23: 3–35.
  8. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion in Clinical Medicine. 9th ed Oxford: Blackwell Publishing 1993.
  9. Odborné usmernenie pre základné vyšetrovacie postupy v imunohematológii 6/2010.
  10. Vestník MZ SR čiastka 1-3 1/2016: Opatrenie Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky z 2. januára 2016 E. S06601-OL-2015 o požiadavkách na sledovanie krvi, zložiek z krvi a transfúznych liekov, na formu a spôsob oznamovania závažných nežiadúcich reakcii a závažných nežiadúcich udalosti a na vyhodnocovanie ich príčin a na normy a špecifikácie súvisiace so systémom kvality v transfúziologických zariadeniach.

 

Hodnotenie článku

inVitro 4/2016

Hematológia

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 4/2016 Hematológia. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro