Chemoimunoterapia – kardinálny reštart protinádorovej imunity

Úspešné prekonanie ochranného imunosupresívneho valu nádorov prostredníctvom kombinácie štandardných terapeutických postupov a imunoterapie, vrátane aplikácie protinádorových bunkových vakcín a protilátok voči inhibítorom imunitných kontrolných bodov, predstavuje v súčasnosti kľúčový posun v liečbe onkologických ochorení.

Rakovina je genetické ochorenie, ktoré vzniká počas evolučného procesu, keď sa v somatických bunkách nahromadí také množstvo mutácií, ktoré bunky nie sú schopné udržať pod kontrolou prostredníctvom rôznych ochranných a opravných mechanizmov. Prekonanie takejto bunke vlastnej ochrannej bariéry nakoniec vedie k nekontrolovanej expanzii zmutovaných buniek a následne ku vzniku nádorového ochorenia.

Malígne ochorenia dlhodobo predstavujú vážny celosvetový zdravotný problém a ich výskyt sa podľa poslednej správy WHO/IARC World Cancer Report 2014 v nasledujúcich 20 rokoch celosvetovo zvýši
o 57 percent. Súčasné štandardne používané terapie, medzi ktoré patria chirurgické odstránenie nádorov, chemoterapia a rádioterapia, stále nie sú schopné zabezpečiť úplnú elimináciu nádorového ochorenia. Navyše, rakovinové bunky, napriek aplikovanej terapii, stále vykazujú vysokú schopnosť uniknúť spod dohľadu imunitného systému, čo vedie k častým relapsom nádorových ochorení. Aj pre tieto dôvody je cieľom budúcich terapií nádorových ochorení, vrátane aplikácie protinádorových vakcín a imunoterapie, aktivácia a restimulácia imunitného systému pacienta tak, aby tento dokázal zabrániť úniku rakovinových buniek spod jeho kontroly a aby aplikovaná imunoterapia navyše dokázala navodiť účinnú, dlhodobo trvajúcu bunkovú a protilátkovú imunitnú odpoveď voči antigénom, ktoré sú špecificky exprimované v nádoroch pacienta. Okrem toho, úspešná imunoterapia musí byť schopná viesť k eliminácii primárnych nádorov a metastáz, zmierneniu a vymiznutiu symptómov rakoviny, výraznému zlepšeniu kvality života pacienta a v neposlednom rade aj k čiastočnej alebo k úplnej remisii nádorového ochorenia.

Prelomovým krokom bolo schválenie prvej autológnej terapeutickej vakcíny Sipuleucel-T, ktorá viedla k stimulácii špecifickej T bunkovej imunitnej odpovede voči kyslej prostatickej fosfatáze, antigénu exprimovanom väčšinou buniek karcinómu prostaty.
Prelomovým krokom bolo schválenie prvej autológnej terapeutickej vakcíny Sipuleucel-T, ktorá viedla k stimulácii špecifickej T bunkovej imunitnej odpovede voči kyslej prostatickej fosfatáze, antigénu exprimovanom väčšinou buniek karcinómu prostaty.

Nádorové mikroprostredie

Nádory predstavujú komplexný heterogénny systém zložený jednak zo samotných rakovinových buniek, ale aj z rôznych nemalígnych typov buniek vrátane buniek imunitného systému, nádorovo asociovaných fibroblastov, vaskulárnych a lymfatických endotelových buniek. Všetky tieto typy buniek aktívne spolupracujú na progresii nádorového ochorenia a spolu vytvárajú tzv. nádorové mikroprostredie. Vplyvom zvýšenej citlivosti voči mutagénom, nárastu počtu nahromadených mutácií a straty kontroly bunky opravovať poškodené gény nadobúdajú rakovinové bunky schopnosť vo zvýšenej miere produkovať rastové faktory, ako aj exprimovať receptory pre rastové faktory. Rakovinové bunky sú navyše schopné ovplyvňovať funkciu stromálnych buniek a tiež stimulovať ich produkciu rastových faktorov. Zvýšená expresia receptorov pre rastové faktory na povrchu rakovinových buniek im zabezpečuje zvýšený prísun potrebných rastových faktorov a proliferačných signálov a zároveň výrazne znižuje ich dostupnosť pre nemalígne, zdravé bunky. Zmutované tumor supresorové gény v rakovinových bunkách nie sú schopné zabezpečiť fungovanie kontrolných mechanizmov určujúcich, či bunka môže ďalej proliferovať, prípadne je jej bunkový cyklus permanentne zastavený, alebo bunka zomiera formou programovanej smrti. Rakovinové bunky preto úspešne ignorujú rastové inhibičné signály, keďže poškodené kontrolné mechanizmy nedokážu zabrániť nekontrolovanej proliferácii rakovinových buniek. Navyše, napriek veľkému počtu zmutovaných génov a defektných proteínov dokážu rakovinové bunky efektívne inhibovať expresiu proteínov indukujúcich apoptózu a permeabilitu vonkajších membrán mitochondrií. Spolu so zvýšenou expresiou antiapoptotických proteínov tak efektívne inhibujú proces apoptózy, prípadne iných foriem programovanej bunkovej smrti. Zápalový proces v nádore prostredníctvom zvýšenej produkcie zápalových cytokínov a proangiogénnych faktorov systematicky poskytuje ďalšie informácie týkajúce sa poškodenia tkaniva, čím dochádza k zvýšenej migrácii buniek zodpovedných za opravu poškodených tkanív, ako sú napríklad imunosupresívne nádorovo asociované M2 makrofágy. Navyše, zvýšená produkcia rastových faktorov v nádorovom mikroprostredí, ako napríklad VEGF, aktívne podporuje angiogenézu v nádorovej mase a blokuje protinádorovú imunitu vrátane inhibície procesu dozrievania dendritických buniek, ako aj aktivácie T buniek. Zvýšená produkcia proteolytických enzýmov a enzýmov degradujúcich extracelulárny matrix, či už rakovinovými bunkami, ale aj nádorovo asociovanými nemalígnymi bunkami, podporuje invazívnosť rakovinových buniek do okolitého tkaniva, ciev a lymfatického systému, čím dochádza k zvýšenej migrácii rakovinových buniek do vzdialených tkanív a k formovaniu mikrometastáz, ktoré sa ďalej môžu rozvinúť do makroskopických nádorov. Rast niektorých mikrometastáz môže byť kontrolovaný prostredníctvom systémových supresorových faktorov produkovaných primárnym nádorom. Takýto typ mikrometastáz potom vykazuje zvýšený rast až po resekcii primárneho nádoru. Na druhej strane, niektoré typy nádorov, ako napríklad melanómy alebo karcinómy prsníka, produkujú mikrometastázy, ktoré sú v stave latencie aj desiatky rokov po resekcii, prípadne farmakologickom odstránení primárneho zdroja. Tieto typy mikrometastáz môžu začať vykazovať zvýšenú aktivitu vplyvom zmeny celkového systémového prostredia, napríklad pri oslabení celkovej imunity pacienta.

Rakovinové bunky samotné alebo prostredníctvom iných buniek nádorového mikroprostredia dokážu úspešne uniknúť spod kontroly imunitného systému. Prostredníctvom navodenia stavu chronického zápalu dochádza v nádore k jeho aktívnemu zásobovaniu bioaktívnymi molekulami, ako sú rastové a proangiogénne faktory a extracelulárne matrix modifikujúce enzýmy zohrávajúce kľúčovú úlohu v angiogenéze a metastázovaní rakovinových buniek. Navyše uvoľňovanie toxických a mutagénnych molekúl, ako sú napríklad reaktívne formy kyslíka (ROS), vedie k poškodzovaniu okolitých buniek, podpore chronického zápalového procesu, a tým aj k zvýšenej migrácii myeloidných buniek, neutrofilov, mastocytov, makrofágov a regulačných T buniek do nádorového mikroprostredia. 

Rakovinové bunky dokážu prostredníctvom zvýšenej produkcie imunosupresívnych cytokínov ako TGF-β, IL-10 a iných imunosupresívnych faktorov ako VEGF, PDGF, PGE2, Arg1, iNOs, ROS, COX2, ďalej zvýšeným metaboliznom cysteínu, degradáciou tryptofánu prostredníctvom IDO účinne inhibovať funkciu efektorových buniek imunitného systému a celkovú protinádorovú imunitu. Ďalej dokážu efektívne polarizovať naivné T bunky na regulačné T bunky a klasicky aktivované, prozápalové fagocytujúce M1 makrofágy na protizápalové, alternatívne aktivované M2 makrofágy, ktoré významne prispievajú k budovaniu nádorového mikroprostredia a k angiogenéze. 

V nádorovom mikroprostredí navyše dochádza k vytváraniu štruktúr, ktoré sú funkčne podobné lymfoidným tkanivám imunitného systému. Vplyvom imunosupresívnych faktorov a cytokínov tak v nádore vo zvýšenej miere dochádza k polarizácii naivných T buniek na regulačné, k inhibícii funkčného dozrievania dendritických buniek a takisto k neúspešnej prezentácii antigénov prostredníctvom dendritických buniek, čo vedie k vzniku imunosupresorových buniek. Dendritické bunky po fagocytóze nádorových antigénov vplyvom chemokínov produkovaných v lymfoidných štruktúrach nádoru putujú do týchto „imunosupresívnych“ štruktúr s cieľom prezentovať antigén T bunkám a indukovať T bunkovú imunitnú odpoveď. Avšak vplyvom imunosupresívnych faktorov dendrické bunky nie sú schopné funkčne dozrieť a prezentácia antigénov takými „neúplne zrelými“ dendritickými bunkami vedie k navodeniu T bunkovej tolerancie a k vzniku anergických T buniek, zredukovaniu počtu antigén špecifických T buniek alebo k ich polarizácii na indukované regulačné T bunky. Navyše, takéto imunosupresívne nezrelé dendritické bunky v nádorovom mikroprostredí exprimujú vo zvýšenej miere ligand pre proteín 1 bunkovej smrti (PD-L1), naopak minimálne exprimujú kostimulačné molekuly, majú zníženú produkciu prozápalových cytokínov a schopnosť reagovať na prítomnosť molekulárnych vzorov súvisiacich s poškodením tkanív, čím výrazne prispievajú k imunosupresii efektorových nádorovo špecifických infiltrujúcich T buniek.

Mutácie v génoch kódujúcich proteíny, ktoré sú súčasťou komplexnej sústavy spracovania a prezentácie antigénov prostredníctvom molekúl MHC triedy I, vedú k nedostatočnej prezentácii antigénových epitopov, a tým k ich nedostatočnému rozpoznaniu prostredníctvom T bunkových receptorov na povrchu efektorových T buniek. Za normálnych podmienok je každý proteín, ktorý je exprimovaný v bunke, proteolyticky zdegradovaný v proteozóme na peptidy a tie sú následne transportované do endoplazmatického retikula. Tu dochádza k primárnej tvorbe komplexu s príslušnými molekulami MHC triedy I a k ich transferu cez Golgiho systém na povrch buniek. Takto exprimované komplexy medzi peptidom (antigénnym epitopom) a molekulou MHC triedy I môžu byť rozpoznané prostredníctvom antigén špecifických cytotoxických T buniek. V prípade rakovinových buniek hromadiacich veľké množstvá mutácií a exprimujúcich defektné a zmutované proteíny by mali byť epitopy pochádzajúce z takýchto proteínov, prezentované v komplexe s molekulami MHC triedy I, okamžite rozpoznané cytotoxickými T bunkami. V ďalšom kroku by boli rakovinové bunky prezentujúce takéto peptidy následne eliminované cytotoxickými T bunkami. Avšak okrem vyššie uvedených základných charakteristík rakovinových buniek majú tieto mnohopočetné funkčné defekty v jednotlivých dráhach prezentácie antigénov v komplexe s molekulami MHC, a preto cytotoxické bunky nie sú schopné rozpoznať epitopy zmutovaných proteínov, ktoré by za normálnych podmienok mali byť prezentované na povrchu buniek. Mnohé štúdie tiež preukázali, že po identifikácii takýchto defektov a po obnovení funkčnosti jednotlivých dráh prezentácie antigénov došlo k efektívnemu rozpoznaniu rakoviných buniek cytotoxickými T bunkami.

Komplexné zhodnotenie dostupných biomarkerov pri imunoterapii nádorov určuje výsledný efekt liečby

Imunoterapia nádorových ochorení predstavuje nový, celosvetovo stúpajúci trend v liečbe rakoviny a pacientom prináša väčšiu nádej úspešne sa vyliečiť alebo aspoň – pri pozitívnej klinickej odpovedi na imunoterapiu – dosiahnuť výrazné dlhodobé zlepšenie kvality ich života. Tento trend potvrdzuje aj schválenie nových typov liečby rakoviny formou imunoterapie prostredníctvom FDA (The Food and Drug Administration) a EMA (European Medicines Agency) v posledných piatich rokoch. Prelomovým krokom bolo schválenie prvej autológnej terapeutickej vakcíny Sipuleucel-T, ktorá viedla k stimulácii špecifickej T bunkovej imunitnej odpovede voči kyslej prostatickej fosfatáze, antigénu exprimovanom väčšinou buniek karcinómu prostaty. Ipilimumab, monoklonová protilátka blokujúca väzbu antigénu A4 cytotoxických T buniek (CTLA-4), výrazne zvýšil prežívanie pacientov s malígnym melanómom. V roku 2014 schválila FDA pre liečbu malígneho melanómu nivolumab a pembrolizumab, prvé inhibítory imunitných kontrolných bodov, pričom minulý rok boli tieto imunoterapeutiká schválené aj pre liečbu nemalobunkového karcinómu pľúc.

Vážnym problémom pri nádorových ochoreniach je ich neskorá diagnostika, prípadne nemožnosť ich včasnej diagnostiky v dôsledku asymptomatického rastu nádorov. Z týchto dôvodov bývajú nádory vo väčšine prípadov diagnostikované až v pokročilom štádiu, keď je okolo nádorovej masy vybudované komplexné mikroprostredie bohaté na supresorové bunky a imunosupresívne cytokíny a chemokíny. Navyše, chronický zápalový proces, charakteristický pre nádory počas ich rastu, je zodpovedný za zvýšenú prítomnosť regulačných T buniek, funkčne inaktívnych efektorových buniek, ako aj za inhibíciu imunitnej odpovede voči dlhodobo exprimovaným nádorovo asociovaným antigénom, ktoré môžu byť imunitným systémom považované za vlastné antigény. Hlavným cieľom nádorovej imunoterapie, vrátane liečby pacientov prostredníctvom terapeutických protinádorových vakcín, je aktivácia a restimulácia imunitného systému pacienta prostredníctvom navodenia vysokoúčinnej bunkovej a protilátkovej imunitnej odpovede voči nádorovým antigénom a remodulácia imunosupresívneho nádorového mikroprostredia tak, aby navodená imunita voči nádorom bola úplne alebo do maximálne možnej miery schopná eliminovať všetky nádorové bunky tak v primárnych nádoroch, ako aj v metastázach. 

Ľudské nádory exprimujú rôzne typy antigénov, ktoré sú rozpoznávané autológnymi T bunkami a ktoré môžeme rozdeliť do niekoľkých skupín: 1. nádorovo špecifické antigény, 2. diferenciačné antigény, 3. antigény vzniknuté bodovými mutáciami v génoch, 4. antigény bežne exprimované v normálnych zdravých tkanivách, ale s výrazne zvýšenou expresiou v nádorových bunkách.

V mnohých prípadoch nádorové bunky nie sú rozpoznávané imunitným systémom. Tento únik spod imunologického dohľadu môže nastať v dôsledku zníženej expresie alebo úplnej straty relevantných nádorových antigénov, ako aj v dôsledku porušených mechanizmov spracovania a prezentácie nádorových antigénov. Nízke hladiny príslušných epitopov na povrchu nádorových buniek majú za následok problematické rozpoznávanie špecifickými T bunkami. Navyše, mnohé nádorové antigény považuje imunitný systém (vzhľadom na dlhodobú expresiu rakovinovými bunkami, ale aj ich expresiu inými, normálnymi zdravými bunkami a tkanivami) za telu vlastné a na ich prítomnosť nereaguje, aby nedošlo k aktivácii autoimunity. 

Najvýznamnejším typom nádorových antigénov z hľadiska stimulácie účinnej protinádorovej imunity sú preto nádorovo špecifické antigény, medzi ktoré sa zaraďujú aj takzvané nádorové neoantigény. Tieto pre pacienta vysoko špecifické, a jedinečné nádorové sekvencie vznikajú zo zmutovaných proteínov, keď nefunkčné alebo inhibované opravné mechanizmy rakovinových buniek nedokážu včas opraviť poškodené gény. Množstvo a prítomnosť takýchto antigénov priamo závisí od stupňa mutácií v rakovinových bunkách. Nádorové neoantigény predstavujú vysoko špecifické, exogénne, telu cudzie proteíny/antigény, a preto tieto po fagocytovaní, spracovaní a prezentovaní prostredníctvom dendritických buniek naivným T bunkám vedú k vyvolaniu špecifickej protinádorovej imunitnej odpovede. V nádoroch, pre ktoré je charakteristická prítomnosť rakovinových buniek s vysokým počtom mutácií (nadmieru zmutované nádory) bola potvrdená zvýšená expresia molekúl inhibujúcich imunitné odpovede, ale na druhej strane minimálna prítomnosť imunosupresorových buniek. Naopak, „nezmutované“ nádory pozostávajúce z rakovinových buniek s nízkym počtom mutácií sú charakteristické vysokou prítomnosťou imunosupresorových buniek a zníženou expresiou MHC molekúl. Vysoký počet mutácií v rakovinových bunkách a zvýšená expresia nádorových antigénov indikujú prítomnosť spontánnej nádorovo špecifickej imunity a možnosť ďalšej aktivácie imunitného systému, napríklad prostredníctvom protinádorových vakcín. Jedným z biomarkerov predpokladanej účinnosti vakcín, ako aj iných foriem imunoterapie, je preto stanovenie stupňa mutácie nádoru. 

Ďalším znakom nádorov, ktoré by mohli byť účinne rozpoznávané efektorovými bunkami po imunoterapii, sú tie, v ktorých bola potvrdená prítomnosť buniek infiltrujúcich nádory (TILs, eng. Tumor Infiltrating Lymphocytes). Zvýšený počet TILs v niektorých typoch nádorov priamo súvisí so zlepšenou klinickou odpoveďou a dobrou prognózou pre regresiu ochorenia. Ich prítomnosť poukazuje na to, že rakovinové bunky sú schopné poskytnúť imunitnému systému špecifické antigény a tento po ich spracovaní dokáže následne stimulovať antigén špecifickú T bunkovú imunitnú odpoveď. Avšak je dôležité nezabúdať na fakt, že infiltrácia nádorov efektorovými imunitnými bunkami ešte negarantuje ich elimináciu a vyliečenie pacienta.

Rakovinové bunky, ako aj mnohé ďalšie nemalígne bunky prítomné v nádore, môžu exprimovať molekuly patriace do skupiny imunitných regulačných mechanizmov (kontrolných bodov), medzi ktoré patria CTLA-4, receptor a ligand pre proteín 1 bunkovej smrti (PD1 a PD-L1), imunoglobulín T buniek mucín 3 (TIM-3) a aktivačný gén buniek 3 (LAG-3). Expresia týchto molekúl na povrchu efektorových T buniek je charakteristická pre funkčne inaktívne T bunky. Tieto síce prostredníctvom svojich T bunkových receptorov dokážu rozpoznávať epitopy z nádorových antigénov prezentované na povrchu rakovinových buniek v komplexe s molekulami MHC, ale negatívne signály z buniek nádorového mikroprostredia väzbou na receptory imunitných kontrolných bodov inhibujú ich produkciu cytokínov, chemokínov, perforínov a degranuláciu, čím vlastne účinne zabránia ich primárnemu cieľu, ktorým je zabiť rakovinovú bunku. Imunoterapia prostredníctvom protilátok blokujúcich väzby receptor-ligand týchto imunitných kontrolných bodov spôsobuje odblokovanie existujúcej spontánnej imunitnej odpovede a dokázala významne zvýšiť účinnosť liečby niektorých typov nádorov ako napríklad malígneho melanómu a nemalobunkového karcinómu pľúc. Detekcia prítomnosti týchto biomarkerov v nádore a následná aplikácia liečby kombinujúcej protinádorové vakcíny a protilátky voči inhibítorom imunitných kontrolných bodov môže výrazne ovplyvniť celkový a konečný účinok zvolenej terapie nádorového ochorenia.

Prítomnosť imunosupresívnych buniek v nádore a v periférnej krvi predstavuje pre väčšinu nádorov zlý prognostický faktor. Napriek tomu, že vo väčšine prípadov zvýšený počet regulačných T buniek (CD4+FOXP3+CD25++CD127- ) indikuje negatívnu prognózu, sú štúdie, ktoré uvádzajú, že prítomnosť regulačných T buniek v určitých typoch solídnych nádorov, ako sú karcinóm prsníka a kolorektálny karcinóm, predikuje naopak priaznivú odpoveď nádoru na terapiu. Nárast počtu myeloidných supresorových buniek (Lin- CD14- HLA-DR - CD15+CD34+CD11b+CD33+CD13+) zvyčajne priamo koreluje so zvýšenou aktivitou a progresiou nádorov, naopak pokles ich počtu počas terapie súvisí so zlepšeným prežívaním pacientov. Mnohé nezávislé štúdie takisto potvrdili, že vysoká koncentrácia nádorovo asociovaných M2 makrofágov (CD68+CD163+CD206+) súvisí s veľmi negatívnym výhľadom na celkové prežívanie pacientov po liečbe. 

Cieľom imunoterapie je prinútiť imunitný systém pacienta rozpoznávať rakovinové bunky ako nebezpečenstvo a toto ako celok eliminovať prostredníctvom efektorových, plne funkčných buniek imunitného systému. Vzhľadom na schopnosti rakovinových buniek manipulovať niektoré kľúčové bunky imunitného systému, úspešnosť zvolenej imunoterapie do veľkej miery závisí od komplexného zhodnotenia prítomnosti imunosupresorových imunitných buniek jednak v nádore, ako aj v periférnej cirkulácii. Ich eliminácia prostredníctvom vhodne zvolenej chemoterapie umožní výrazne zvýšiť celkový účinok imunoterapie, a tým aj klinickú odpoveď pacienta na imunoterapiu.

Napriek v súčasnosti dosiahnutým pozitívnym výsledkom pri imunoterapii onkologických ochorení s použitím jednak schválených imunoterapeutík, ako aj tých, ktoré sú v súčasnosti v druhej a tretej fáze klinického skúšania, imunomonitoring pacientov počas liečby a po liečbe preukázal, že nie každý pacient dokáže úspešne zareagovať na imunoterapiu. Navyše, u časti pacientov s pozitívnou reakciou na imunoterapiu boli zaznamenané niektoré nežiaduce vedľajšie účinky. Preto je pri výbere pacientov/kandidátov na liečbu imunoterapiou veľmi dôležité komplexne „vyhodnotiť“ každého pacienta s cieľom aspoň čiastočne predpovedať úspešnosť aplikovanej imunoterapie. Keďže imunoterapia stále nepredstavuje rovnaký štandard ako napríklad chemoterapia alebo rádioterapia, v súčasnosti existujú limitované odporúčania, ktoré by sa pri výbere pacientov mali brať do úvahy. Napriek tomu mnohé klinické výskumné pracoviská intenzívne pracujú na identifikácii nových biomarkerov s použitím najnovších technológií vrátane sekvenovaní celkového exómu identifikovaných neoantigénov, stanovení génových znakov a epigenetických modifikácií rakovinových buniek a buniek imunitného systému, proteínovej microarray, prietokovej a hmotnostnej cytometrie, sekvenovaní B bunkových a T bunkových receptorov a imunohistochemického farbenia. Na základe v súčasnosti publikovaných výsledkov sa v najbližších rokoch očakáva stanovenie štandardného protokolu na identifikáciu vhodných pacientov pre liečbu imunoterapiou. 

Protinádorové bunkové vakcíny

Jedným z kľúčových faktorov pre stimuláciu účinnej protinádorovej imunity je prítomnosť vysoko špecifického a jedinečného nádorového antigénu, jeho spracovanie a prezentácia prostredníctvom plne funkčných zrelých dendritických buniek. Zo skupiny profesionálnych buniek prezentujúcich antigény sú to práve dendritické bunky, ktoré ako jediné dokážu aktivovať naivné T bunky a iniciovať primárnu imunitnú odpoveď. Ostatné typy profesionálnych buniek prezentujúcich antigény, makrofágy a B bunky, dokážu prezentáciou antigénu stimulovať len proliferáciu už predtým aktivovaných antigén špecifických T buniek, ale nie sú schopné stimulovať primárnu imunitnú odpoveď voči antigénu.

Dendritické bunky, označované ako najprofesionálnejšie bunky prezentujúce antigény, sú rozhodujúcou súčasťou imunitného systému, nevyhnutnou pre iniciáciu a moduláciu T bunkových imunitných odpovedí in vivo. Dendritické bunky sú schopné priamo aktivovať antigén špecifické cytotoxické T bunky a produkciu protilátok závislú od T buniek. Na druhej strane však dendritické bunky dokážu pri prezentácii antigénu veľmi účinne navodiť imunologickú toleranciu. Dendritické bunky prítomné v periférnych tkanivách a sekundárnych lymfatických orgánoch majú vysokú fagocytovú aktivitu, pričom dokážu pohlcovať antigény, ale aj poškodené a zomierajúce bunky prostredníctvom rôznych mechanizmov, ako sú fagocytóza, makropinocytóza, trogocytóza, receptorom sprostredkovaná endocytóza alebo internalizáciou exozómov. Fagocytóza rozpustných antigénov cez manózové receptory (glykozylované antigény) a Fc receptory (imunoglobulíny) významne zvyšuje účinnosť prezentácie antigénu. Dendritické bunky sú schopné internalizovať a prezentovať antigén v 100-násobne nižšej koncentrácii, ak sú tieto fagocytované prostredníctvom Fc receptoru v porovnaní s makropinocytózou. Stimulácia efektívnej adaptívnej imunitnej odpovede je úzko prepojená s procesom dozrievania dendritických buniek, ktorý ovplyvňuje prezentáciu antigénových epitopov v komplexe s molekulami MHC, expresiu kostimulačných molekúl a produkciu cytokínov. 

Myeloidné dendritické bunky vznikajú z takzvaných prekurzorových dendritických buniek, ktoré po uvoľnení z kostnej drene do krvného obehu a migrácii do cieľových tkanív diferencujú na nezrelé dendritické bunky. Nezrelé dendritické bunky dokážu prostredníctvom povrchových receptorov veľmi účinne rozpoznať prítomnosť antigénov a molekulárnych vzorov súvisiacich s patogénmi (PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Patterns) alebo s poškodením buniek (DAMPs, Damage-Associated Molecular Patterns). Po internalizácii antigénov a aktivácii povrchových receptorov rozpoznávajúcich tieto vzory (PRRs, Pattern Recognition Receptors) nadobúdajú dendritické bunky migračnú schopnosť a putujú cez aferentné lymfatické dráhy do lokálnych lymfatických uzlín. Už počas tejto migrácie začína proces funkčného dozrievania dendritických buniek, ktorý je charakteristický spracovaním antigénu a prezentáciou jeho epitopov prostredníctvom molekúl MHC, zvýšenou expresiou kostimulačných molekúl a produkciou cytokínov. Úspešné ukončenie procesu dozrievania dendritických buniek vyžaduje vzájomnú komunikáciu medzi dendritickou bunkou a CD4+ T bunkou prostredníctvom interakcie medzi povrchovým receptom dendritických buniek CD40 a jeho ligandom na povrchu CD4+ T buniek (CD40L). Tento signál je kľúčový pre nárast expresie kostimulačných molekúl, produkciu príslušných polarizačných cytokínov a prezentáciu exogénnych antigénov prostredníctvom molekúl MHC triedy I, ktorá sa označuje ako krížová prezentácia antigénu alebo cross-priming. 

Účinná aktivácia a proliferácia naivných a centrálnych pamäťových T buniek vyžaduje interakciu T bunkového receptora s epitopom z príslušného antigénu prezentovanom prostredníctvom molekúl MHC (signál 1) a vzájomnú interakciu medzi kostimulačnými molekulami exprimovanými na povrchu dendritických buniek (CD80, CD86, CD70, OX40L, 4-1BBL) a T buniek (CD28, CD27, OX40, 4-1BB) (signál 2). Funkčná polarizácia aktivovaných T buniek (Th1, Th2, Th9, Th17, Th22) navyše vyžaduje produkciu a sekréciu príslušných cytokínov prostredníctvom zrelých dendritických buniek (signál 3). Tento signál je kľúčový pre tvorbu funkčne plnohodnotných cytotoxických T buniek (Obrázok č. 1).

Obrázok č. 1: Stimulácia T buniek prostredníctvom zrelých, plne funkčných dendritických buniek
Obrázok č. 1: Stimulácia T buniek prostredníctvom zrelých, plne funkčných dendritických buniek

Mnohé experimentálne štúdie potvrdili jedinečné schopnosti dendritických buniek stimulovať klinicky významnú, dlhodobo trvajúcu, protinádorovú imunitnú odpoveď s minimálnymi vedľajšími účinkami po aplikácii protinádorových bunkových vakcín. Dendritické bunky predstavujú v súčasnosti najatraktívnejší systém na prípravu protinádorových bunkových vakcín. Možnosť prípravy dendritických buniek z periférnych monocytov ex vivo viedlo k intenzívnej vedeckej činnosti na významných klinických pracoviskách s cieľom pripraviť účinnú protinádorovú vakcínu z dendritických buniek pre rôzne typy nádorových ochorení. V EU a v USA bolo doteraz zaregistrovaných viac než 500 klinických štúdií sledujúcich účinok terapeutických bunkových protinádorových vakcín pripravených z dendritických buniek. Klinická štúdia hodnotiaca použitie protinádorových bunkových vakcín z dendritických buniek v kombinácii so štandardnou liečbou pacientov s pokročilým karcinómom pľúc by sa v súčasnosti mala realizovať aj na dvoch pracoviskách na Slovensku. 

Výhodou príprav bunkových vakcín ex vivo je úplné obmedzenie imunosupresívneho a systematického vplyvu nádoru, čo dendritickým bunkám umožní plnohodnotne dozrieť „v normálnom, zdravom“ prostredí. Pri príprave protinádorových bunkových vakcín sa ako zdroj antigénov používajú definované nádorovo asociované antigény vo forme proteínov, prípadne peptidov, transfekcia dendritických buniek pomocou RNA alebo DNA kódujúcich definované antigény alebo aj imunostimulačné molekuly ako napríklad cytokíny, chemokíny alebo kostimulačné molekuly s cieľom dosiahnuť ich expresiu v cytoplazme dendritických buniek, a tak zabezpečiť sekréciu a účinnú prezentáciu antigénov prostredníctvom molekúl MHC triedy I. Významným zdrojom antigénov sú aj alogénne a autológne nádorové bunky a ich lyzáty. Možnosť použiť ako zdroj antigénov chirurgicky odstránený nádor pacienta, v ktorom bola navyše potvrdená vysoká prítomnosť neoantigénov, predstavuje jedinečný spôsob ako zabezpečiť stimulovanie primárnej imunitnej odpovede voči takýmto vysoko imunogénnym a jedinečným nádorovo špecifickým antigénom. V súčasnosti navyše existuje niekoľko spôsobov ako aktivovať imunogénnu smrť buniek získaných z nádoru, keď dochádza k uvoľňovaniu molekulárnych vzorov (zo zomierajúcich buniek) súvisiacich s poškodením buniek, povrchovej expresii takzvaných „find me“ a „eat me“ signálov, a tým aj k účinnejšej fagocytóze nádorových antigénov dendritickými bunkami, ich spracovaniu a následnej prezentácii.

Z biologických materiálov pacienta, ktoré predstavujú časť chirurgicky odstráneného nádoru a monocyty získané z periférnej krvi prostredníctvom leukaferézy, je možné pripraviť až 15 dávok protinádorovej bunkovej vakcíny, a tak zabezpečiť jej dlhodobé podávanie a dosiahnuť požadovaný účinok – stimulovanie efektívnej protinádorovej imunity vedúcej k eliminácii nádoru. Príprava vakcíny musí byť realizovaná v certifikovaných GMP laboratóriách a celková doba jej prípravy je vo väčšine prípadov menej ako 7 dní. Z praktického hľadiska predstavuje príprava dendritických buniek nenáročnú a ľahko adaptovateľnú technológiu. Prvé experimentálne štúdie s dendritickými bunkami boli predmetom skúmania v Ústave experimentálnej onkológie SAV už v roku 2001.

Zdĺhavý a finančne náročný proces registrácie a schválenia použitia protinádorových bunkových vakcín na klinické skúšanie významne spomaľuje dostupnosť tohto typu terapie onkologickým pacientom. Ďalším z limitujúcich faktorov ovplyvňujúcich klinické podávanie súčasných protinádorových bunkových vakcín je chýbajúci štandardný protokol na prípravu zrelých dendritických buniek. Spoločnosti a laboratóriá, ktoré sa zaoberajú vývojom a prípravou bunkových imunoterapeutických vakcín z dendritických buniek, používajú vlastné kombinácie stimulov pre dozrievanie dendritických buniek, pričom vo väčšine prípadov ide o kombináciu cytokínov a PRRs agonistov. Tieto informácie sú navyše v mnohých prípadoch – v dôsledku ich dôverného charakteru – verejne neprístupné. Aj preto je náročné zhodnotiť skutočný terapeutický prínos protinádorových vakcín pripravených z dendritických buniek pacienta a to aj napriek tomu, že väčšina realizovaných klinických štúdií deklaruje pozitívnu klinickú odpoveď.

Chemoimunoterapia – chemoterapia kombinovaná s imunoterapiou – kľúč k účinnej liečbe rakoviny?

Súčasná štandardne používaná chemoterapia dokáže výrazne zasiahnuť rakovinové bunky a spomaliť progresiu nádoru, ale jej celkový efekt je vo väčšine prípadov dočasný, keďže účinnosť chemoterapie trvá vo väčšine prípadov len počas doby podávania chemoterapie a zasahuje len rýchlo proliferujúce bunky. Navyše, prerušenie podávania chemoterapie zvyčajne vedie k vzniku rezistencie voči chemoterapeutikám, zvýšenému rastu nádorov a v mnohých prípadoch až k relapsom ochorenia, ktoré môžu viesť k smrti pacientov (Obrázok č. 2A). 

Obrázok č. 2: Progresia nádorového ochorenia po jednoduchej a kombinovanej terapii (zdroj: Adv Cancer Res. 2014;121:67)
Obrázok č. 2: Progresia nádorového ochorenia po jednoduchej a kombinovanej terapii (zdroj: Adv Cancer Res. 2014;121:67)

Imunoterapeutický efekt má po aplikácii protinádorovej vakcíny síce pomalší nástup (vzhľadom na čas potrebný na stimuláciu špecifickej imunitnej odpovede voči nádorovým antigénom použitým pri príprave vakcíny), ale výsledný účinok na klinickú odpoveď pacienta je po aplikovaní vakcíny omnoho významnejší a dlhšie trvajúci než klinická odpoveď detegovaná po aplikácii konvenčnej chemoterapie (Obrázok č. 2A). 

Správne načasovanie imunoterapie je pri liečbe onkologických ochorení jedným z kľúčových faktorov jej úspešnosti, keďže pri liečbe pacientov, u ktorých bola preukázaná prítomnosť výrazne veľkej nádorovej masy – či už z dôvodu neskorej diagnostiky alebo rýchlej progresie ochorenia – je výsledný terapeutický efekt pri liečbe samotnou imunoterapiou minimálny, keďže nádor má vybudované silno imunosupresívne mikroprostredie. Avšak pri včasnej detekcii nádorového ochorenia a skorej aplikácii protinádorových vakcín, keď nádorové mikroprostredie ešte nie je úplne rozvinuté a nie je silne imunosupresívne, je klinická odpoveď po aplikácii imunoterapie oveľa výraznejšia a dochádza k významnému predĺženiu celkového terapeutického efektu (Obrázok č. 2B).

Chemoterapia bola v minulosti považovaná za typ silno imunosupresívnej liečby. Súčasné štúdie však preukázali, že niektoré druhy chemoterapeutík môžu mať naopak imunostimulačný efekt závislý od dávky a doby podávania konkrétneho chemoterapeutika. Tieto výsledky podporujú nový koncept liečby rakoviny, ktorým je kombinácia cytostatík a imunoterapie – chemoimunoterapia. Existuje veľa dôkazov, že imunitný systém dokáže rozpoznávať imunogénne nádory, preto je pre vývoj a dizajn budúcich postupov v liečbe rakoviny veľmi povzbudivé, že niektoré v súčasnej dobe štandardne používané chemoterapeutiká dokážu vyvolať imunogénnu smrť rakovinových buniek, a tým jednak zvýšiť imunogenicitu nádoru, ale aj pozitívne ovplyvniť (re)stimuláciu protinádorovej imunitnej odpovede. Navyše, mnohé chemoterapeutiká okrem zabíjania rakovinových buniek dokážu eliminovať aj imunosupresívne imunitné bunky v nádorovom mikroprostredí, čím nepriamo umožnia infiltráciu nádorovej masy prostredníctvom efektorových antigén špecifických T buniek a antigén prezentujúcich dendritických buniek. Správne načasovanie kombinovanej liečby by tak malo zabezpečiť účinnú klinickú odpoveď s dlhodobo trvajúcim imunoprotektívnym efektom (Obrázok č. 2C).

Chemoterapeutiká s pozitívnym vplyvom na protinádorovú imunitu možno všeobecne rozdeliť na tie, ktoré stimulujú imunogénnu smrť rakovinových buniek (Doxorubicín, Oxaliplatina, Bortezomib, Cyklofosfamid, Bleomycín, Epirubicín, Idarubicín a Mitoxantrón) a tie, ktoré dokážu eliminovať T regulačné bunky (Cyklofosfamid, Docetaxel, Gemcitabín) a myeloidné supresorové bunky (Paclitaxel, 5-Flurouracil, Gemcitabín).

Zdravý človek stráca každú sekundu milióny buniek, ktoré odumierajú programovanou bunkovou smrťou a ich zvyšky sú z organizmu odstránené bez vyvolania lokálnej alebo systematickej zápalovej reakcie. Takáto programovaná bunková smrť je zvyčajne zrealizovaná prostredníctvom procesu apoptózy, ktorý vedie buď k navodeniu tolerancie voči uvoľneným bunkovým antigénom, alebo vôbec neaktivuje imunitný systém. Určité špecifické stimuly však dokážu aktivovať imunogénny variant programovanej smrti, pričom tento môže stále vykazovať znaky „neimunogénnej“ apoptózy.

Imunogénnou bunkovou smrťou buniek je označovaná forma apoptózy, keď imunitný systém dokáže navodiť špecifickú imunitnú odpoveď voči antigénom, ktoré sú uvoľnené z takto zomierajúcich buniek. Počas imunogénnej bunkovej smrti dochádza k postupnému uvoľňovaniu molekulárnych vzorov súvisiacich s poškodením tkanív (DAMPs). Ide o molekuly, ktoré za normálnych podmienok nie sú prístupné bunkám imunitného systému, ale vplyvom stresu alebo bunkovej smrti dochádza k ich premiestneniu z cytoplazmy alebo jadra na vonkajšiu plazmatickú membránu, kde sa stávajú prístupnými pre všetky bunky okolitého prostredia vrátane buniek imunitného systému. Medzi kľúčové DAMPs imunogénnej bunkovej smrti patria ATP, kalretikulín a proteín HMGB1.

Fyzické alebo chemické poškodenie buniek vedie k extracelulárnemu uvoľneniu ATP, ktoré slúži ako prejav potenciálneho nebezpečenstva. Vzhľadom na to, že stimuluje migráciu fagocytov (makrofágy, dendritické bunky) k poškodenému tkanivu, býva označované aj ako „find me“ signál.

Kalretikulín sa za normálnych podmienok počas homeostázy nachádza väčšinou vo vnútri endoplazmatického retikula, kde funguje ako šaperón. Vplyvom stresu, ionizujúceho žiarenia alebo niektorých chemických látok vrátane chemoterapeutík, ako sú antracyklíny, oxaliplatina atď. dochádza k jeho premiestneniu na vonkajšiu bunkovú membránu. Prítomnosť kalretikulínu na bunkovej membráne, označovaná aj ako „eat me“ signál, slúži na rozpoznanie umierajúcich buniek dendritickými bunkami a makrofágmi a ich následnú internalizáciu. Prítomnosť kalretikulínu na povrchu rakovinových buniek vystavených účinku niektorých chemoterapeutík priamo súvisí s ich fagocytózou dendritickými bunkami a produkciou prozápalových cytokínov potrebných na stimuláciu a polarizáciu IFN-γ produkujúcich cytotoxických CD8+ T buniek so špecificitou voči neoantigénom uvoľneným z nádorových buniek.

Fagocytóza umierajúcich rakovinových buniek a spracovanie prítomných nádorových neoantigénov prostredníctvom dendritických buniek nestačí na ich dostatočnú aktiváciu, ktorá by viedla k prezentácii antigénov a stimulovaniu špecifickej imunitnej odpovede. Dendritické bunky potrebujú signál, ktorý by naštartoval proces ich dozrievania vedúci nielen ku krížovej prezentácii antigénov T bunkám, ale aj k zvýšenej expresii kostimulačných molekúl a produkcii cytokínov, nevyhnutných pre úspešnú Th1 polarizáciu pomocných CD4+ a cytotoxických CD8+ T buniek. 

Počas programovanej bunkovej smrti dochádza k zvýšenej priepustnosti jadrovej a plazmatickej membrány, a tým aj k uvoľneniu jadrových proteínov do extracelulárneho priestoru. Proteín HMGB1 je prítomný v jadre takmer všetkých eukaryotických buniek, kde jeho hlavná funkcia spočíva v udržiavaní stability nukleozómu a regulácii transkripcie génov. Okrem tejto funkcie pôsobí aj ako extracelulárny faktor uvoľňovaný počas rôznych fyziologických a patofyziologických procesov. Pri infekciách, zápale alebo poškodení tkaniva je uvoľňovaný makrofágmi, dendritickými bunkami a NK bunkami. Proteín HMGB1 má vysokú afinitu voči viacerým receptorom vrátane receptorov pre molekulové vzory súvisiace s patogénmi, a to konkrétne TLR (Toll-like receptor)-2, TLR-4 a TLR-9. Aktivácia dendritických buniek cez TLR receptory spúšťa procesy spracovania a prezentácie antigénov vrátane stimulácie dozrievania dendritických buniek a produkcie cytokínov typu Th1 vedúcim k (re)stimulácii efektorových antigén špecifických T buniek.

Vyvolanie imunogénnej programovanej smrti rakovinových buniek (po chemoterapeutickej liečbe) vybranými typmi cytostatík tak spôsobí uvoľnenie troch dôležitých signálov, ktoré zabezpečia zvýšenú migráciu nezrelých dendritických buniek k umierajúcim rakovinovým bunkám (find me), podporia ich rozpoznanie a fagocytózu (eat me) a aktiváciou procesu dozrievania dendritických buniek cez TLR receptory zabezpečia stimuláciu primárnej T bunkovej imunitnej odpovede špecifickej voči neoantigénom prítomným v umierajúcich rakovinových bunkách. Spolu s elimináciou imunosupresorových imunitných buniek v nádorovom mikroprostredí tak chemoterapeutická liečba pripraví vhodné podmienky na aplikáciu protinádorových bunkových vakcín a stimuláciu účinnej protinádorovej imunity, ktorá by mala viesť k úplnej eliminácii rakovinových buniek a zabezpečiť dlhodobú ochranu pacienta pred recidívou nádorového ochorenia.

Na čo by sa nemalo zabudnúť pri príprave protinádorových bunkových vakcín počas a po ich aplikácii

Vedecké štúdie jasne preukázali, že aj nádor môže byť imunogénny, o čom svedčia detegované spontánne, ale aj získané protinádorové imunitné odpovede. Tieto vlastnosti nádorov preto viedli k intenzívnemu hľadaniu vhodného typu protinádorovej vakcíny, ktorá musí byť schopná stimulovať účinnú protinádorovú imunitu a eliminovať všetky formy nádoru prítomné v organizme. 

Najvýznamnejším kandidátom pri vývoji protinádorových bunkových vakcín boli a sú dendritické bunky charakteristické svojou jedinečnou schopnosť aktivovať naivné T bunky a vyvolať efektívne bunkové a protilátkové antigén špecifické imunitné odpovede. Prvýkrát boli tieto bunky popísané študentom medicíny Paulom Langerhansom v roku 1868 v Nemecku, ktorý vo svojej práci uviedol, že epidermálna vrstva kože pozostáva zo siete vytvorenej bunkami, ktoré sú pravdepodobne súčasťou nervového systému a ktoré svojím tvarom pripomínajú hviezdicu alebo rozkonárený strom, a preto ich popísal ako dendritické bunky (z gréčtiny, dendreon, strom). Trvalo viac než 100 rokov, kým Ralph Steinman a Zanvil Cohn v roku 1973 publikovali článok, kde uviedli, že dendritické bunky so svojimi špecifickými vlastnosťami patria do skupiny bielych krviniek, čím sa začala moderná éra dendritických buniek. Následne počas 40-ročného výskumu dendritických buniek bolo jednoznačne preukázané, že tieto profesionálne bunky prezentujúce antigény majú jedinečné imunostimulačné a imunomodulačné vlastnosti a patria medzi najdôležitejšie bunky imunitného systému. Napriek tomu, že prvotné klinické štúdie s bunkovými protinádorovými vakcínami pripravenými z dendritických buniek z 90. rokov minulého storočia nepriniesli v tej dobe očakávané výsledky, dendritické bunky stále predstavujú primárny objekt pri vývoji protinádorových bunkových vakcín.

Nesprávna interpretácia klinických odpovedí po imunoterapii nádorových ochorení v minulosti do istej miery utlmila narastajúci boom imunoterapie vrátane protinádorových bunkových vakcín. Avšak súčasná, prehodnotená interpretácia klinických odpovedí po imunoterapii, ktoré sú výrazne odlišné od tých, ktoré sú pozorované po štandardnej liečbe, ako sú chirurgické odstránenie nádoru, chemoterapia a rádioterapia, vracia imunoterapiu späť do popredia budúcich terapeutických prístupov v liečbe rakoviny. 

Obrázok č. 3: Experimentálny model aplikácie chemoimunoterapie: konvenčná chemoterapia v kombinácii s imunoterapiou - protinádorovou bunkovou vakcínou
Obrázok č. 3: Experimentálny model aplikácie chemoimunoterapie: konvenčná chemoterapia v kombinácii s imunoterapiou - protinádorovou bunkovou vakcínou

Príprava protinádorovej vakcíny z dendritických buniek nepredstavuje zložitý technologický postup. Dendritické bunky sú zvyčajne pripravované z monocytov periférnej krvi (Obrázok č. 3). Ich príprava ex vivo garantuje neimunosupresívne prostredie bez priameho aj nepriameho vplyvu nádorov na ich polarizáciu a dozrievanie. Na zabezpečenie dostatočného počtu monocytov treba získať aspoň jednu transfúznu jednotku krvi pacienta alebo ich treba získať pomocou špeciálnej technológie odberu – leukaferézy. Tým by mala byť zabezpečená príprava 10 – 15 vakcín. Po polarizácii monocytov na nezrelé dendritické bunky, čo trvá v závislosti od zvoleného protokolu 3 až 5 dní, dochádza k inkubácii dendritických buniek s nádorovým antigénom a faktormi, ktoré aktivujú a podporujú dozrievanie dendritických buniek, ako sú napríklad cytokíny alebo TLR agonisty. Po aktivácii v prítomnosti príslušných antigénov je časť dendritických buniek/protinádorových vakcín zmrazená a uskladnená do doby vykonania testov potrebných na potvrdenie kvality vakcíny a uvoľnenia pre kliniku. 

Pred uvoľnením vakcíny na klinické podávanie treba potvrdiť, že pripravené vakcíny sú sterilné a pozostávajú z plne funkčných dendritických buniek s minimálnou kontamináciou CD3+ a CD19+ lymfocytov. Fenotypová analýza dendritických buniek by mala zahŕňať a potvrdiť vysokú expresiu biomarkera zrelých dendritických buniek CD83, vysokú expresiu kostimulačných a antigén prezentujúcich molekúl CD80, CD86 a HLA-DR, expresiu CCR7 biomarkera pre schopnosť dendritických buniek migrovať po aplikácii vakcíny do lokálnych lymfatických uzlín, nízku expresiu biomarkera pre monocyty CD14 a nízku expresiu biomarkerov súvisiacich s navodením tolerancie voči antigénom CD274, CD85k a CD85d. 

Funkčné vlastnosti pripravených dendritických buniek musia byť potvrdené v alogénnych a autológnych testoch zmiešaných lymfocytových reakcií a z cytokínového profilu buniek, ktorý by mal obsahovať analýzu produkcie polarizačných cytokínov Th1 – IFN-γ; Th2 – IL-4, IL-5; Th17 – IL-17A, IL-17F a Treg – IL-10,
TGF-β.

Pri výbere nádorových antigénov na prípravu vakcíny možno postupovať rôznymi smermi (Obrázok č. 3). Pri obmedzenom množstve biologického materiálu pacienta je možné vybrať jeden alebo viacero definovaných nádorovo asociovaných antigénov na základe génového profilu expresie známych nádorových antigénov v biopsii, prípadne v tkanive získanom po chirurgickom odstránení nádoru. Týmto spôsobom je však výber antigénu výrazne obmedzený limitujúcim počtom známych antigénov vo zvolenom testovanom paneli. Navyše, vybrané antigény nemusia byť najimunogénnejšie antigény nádoru a takmer s istotou možno tvrdiť, že nezahŕňajú neoantigény. Panel testovaných antigénov môže byť vytvorený na základe výsledkov z publikovaných štúdií indikujúcich expresiu konkrétnych antigénov pre konkrétne typy nádorov. Pre inkubáciu s dendritickými bunkami môže byť použitý jeden alebo kombinácia viacerých antigénov vo forme proteínov alebo peptidov. Použitie proteínov je výhodné z hľadiska ich spracovania sústavou bunkových organel podieľajúcich sa na spracovaní a z hľadiska ich prezentácie molekulami MHC, keď celkový proteín na rozdiel od definovaných peptidov poskytne kompletnú sekvenciu na prirodzený výber imunodominantného epitopu.

Pri použití jednobunkovej suspenzie pripravenej z chirurgicky odstráneného nádoru pacienta, prípadne z  lyzátu z tejto jednobunkovej suspenzie, sa pre dendritické bunky zabezpečia ako zdroj antigénu vysoko špecifické neoantigény. Tieto antigény vznikajú v malígnych bunkách počas neregulovanej progresie ako produkty zmutovaných génov. Sú charakteristické svojou jedinečnosťou a špecificitou pre každého jedného pacienta. Z dôvodu vysokého stupňa mutácií sú tieto antigény považované imunitným systémom „za cudzorodé“, a preto tento bude považovať bunky, ktoré exprimujú takéto antigény, za choré prípadne poškodené po infikovaní nejakým patogénom. Týmto sa výrazne eliminuje vplyv prirodzených regulačných T buniek a zvýši sa šanca na rozpoznanie a usmrtenie malígnych buniek cytotoxickými T bunkami. 

Použitie autológneho systému pri príprave vakcíny – dendritické bunky pripravené z monocytov periférnej krvi pacienta a antigény z nádoru pacienta – zabezpečí pacientovi vysoko špecifickú vakcínu pripravenú „na mieru“. Zrelé dendritické bunky prezentujú aktuálne exprimované špecifické nádorové neoantigény naivným T bunkám. Vplyvom definovaného maturačného koktailu zloženého z cytokínov a TLR agonistov zrelé dendritické bunky polarizujú naivné T bunky smerom k Th1 typu efektorových cytotoxických a pamäťových T buniek a k stimulácii primárnej protinádorovej imunitnej odpovede.

Ďalšou dôležitou súčasťou liečby pacientov bunkovými protinádorovými vakcínami je výber vhodnej chemoterapie, prípadne rádioterapie, ktorá zabezpečí jednak stimulovanie imunogénnej smrti rakovinových buniek, ako aj elimináciu imunosupresívnych buniek – regulačných T buniek, myeloidných supresorových buniek a nádorovo-asociovaných makrofágov. Keďže každý typ rakoviny vykazuje istý stupeň špecificity, výber vhodnej terapie závisí od klinického onkológa, ktorý posudzuje aktuálny stav pacienta. Niektoré štúdie popísali pozitívny vplyv súbežného, prípadne prelínajúceho sa podávania chemoterapie a imunoterapie na regresiu nádoru (Obrázok č. 3). Tieto terapeutické režimy majú zabezpečiť jednak imunogénnu smrť rakovinových buniek s následným uvoľnením špecifických antigénov v nádorovom mikroprostredí, ako aj elimináciu imunitných supresorových buniek, čím by malo dôjsť k zvýšenej fagocytóze nádorových antigénov dendritickými bunkami a k ich funkčnému dozrievaniu bez vplyvu imunosupresívnych faktorov. Oslabené nádorové mikroprostredie by preto malo byť prístupnejšie pre aktivované cytotoxické T bunky. 

Na posúdenie imunologickej a klinickej účinnosti vakcín je treba zabezpečiť podrobný imunomonitoring, ktorý možno rozdeliť na testy súvisiace s vyšetrením nádorového tkaniva po odstránení primárneho nádoru a nádorového tkaniva zo sekundárnych nádorov (pokiaľ dôjde k ich detekcii po ukončení terapie) a imunologických markerov v periférnej krvi. Pokiaľ nádory nemôžu byť chirurgicky odstránené, mala by sa zabezpečiť aspoň biopsia z takýchto nádorov. 

V nádorových tkanivách by sa mala stanoviť mitotická aktivita prostredníctvom mitotického a Ki-67 indexu, ktoré priamo indikujú progresiu nádoru. Medzi ďalšie parametre, ktoré by mali byť sledované z vyšetrovaných vzoriek nádorových tkanív, patrí stanovenie celkového počtu lymfocytov infiltrujúcich nádory (TILs) a prostredníctvom protilátok voči T bunkovým špecifickým znakom, ako sú CD45RO, CD3, CD4, CD8, CD39, PD1, TIM3 a FOXP3 stanoviť zastúpenie jednotlivých populácií T buniek v nádore vrátane funkčne neaktívnych T buniek. Významným ukazovateľom je aj stanovenie prítomnosti imunosupresorových buniek, ako sú nádorovo asociované makrofágy, kde použitím markerov CD68 a CD163 treba stanoviť pomer M1 a M2 subpopulácií makrofágov a myeloidné supresorové bunky detegovateľné pomocou markerov CD45, CD33 a CD11b.

Analýza krvných markerov by mala byť vykonaná pred začatím celkovej terapie, pred prvou aplikáciou protinádorovej bunkovej vakcíny, po aplikovaní minimálne 4 vakcín, po aplikovaní poslednej vakcíny a 3, 6 a 12 mesiacov po ukončení celého terapeutického cyklu. Dôležitou súčasťou imunomonitoringu je sledovanie počtov imunokompetentných buniek pomocou mutiparametrovej prietokovej cytometrie. Analýzy by mali zahŕňať minimálne stanovenie jednotlivých subpopulácií a funkčných vlastností T buniek (CD3, CD8, CD28, Granzým, Perforín, CD107, CD57, IFN-γ), funkčne inaktívnych T buniek (CD3, CD8, PD1, TIM-3, LAG1), regulačných T buniek (CD4, CD25, FOXP3, CD39, CD73) a myeloidných supresorových buniek (Lin, CD14, HLA-DR, CD15 ,CD34, CD11b, CD33, CD13). Vzhľadom na komplexný charakter tejto metodiky by uvedené analýzy mali byť vykonané výlučne na pracoviskách s dostatočnou praxou v oblasti multiparametrovej prietokovej cytometrie a špičkovým odborným personálom garantujúcim kvalitu spracovania a merania vzoriek. Stanovenie počtu a potvrdenie funkčnosti/špecificity voči použitým nádorovým antigénom by malo byť uskutočnené prostredníctvom ELISPOT-u.

Pri hodnotení klinickej odpovede počas a po aplikácii protinádorových bunkových vakcín je dôležité uvedomiť si fakt, že v niektorých prípadoch môže dôjsť pred regresiou nádoru k jeho zväčšeniu, ba dokonca aj ku vzniku nových lézií, pričom bude ťažko rozlíšiteľné, či ide o nádorovú progresiu alebo zápalový proces navodený aplikáciou vakcín. Zväčšenie nádoru pri imunoterapii (pseudoprogresia) môže indikovať nárast infiltrácie nádoru imunokompetentnými efektorovými bunkami, ale aj progresiu nádorovej masy. V súčasnosti stále neexistujú špecifické biomarkery, ktoré by dokázali potvrdiť rozdiel medzi skutočnou progresiou nádoru a pseudoprogresiou vyvolanou po podaní vakcín. Preto je pred rozhodnutím ukončiť liečbu z dôvodu zväčšenia nádorovej masy dôležité potvrdiť, že ide skutočne o progresiu nádoru a nie o imunoterapeutický efekt vyvolaný vakcínou. Takisto je dôležité mať na pamäti fakt, že klinické prejavy účinnosti liečby a protinádorová aktivita sú po imunoterapeutickej liečbe v porovnaní s chemoterapeutickou oneskorené (Obrázok č. 2A). 

Záver

Účinná protinádorová imunitná odpoveď musí byť schopná úplne eliminovať rozvinuté nádorové ochorenie a tiež poskytnúť dlhodobú ochranu pacienta pred vznikom nových malígnych lézií.

Výsledky z klinických štúdií publikované v posledných dvoch rokoch, ktorých cieľom bolo preukázať účinnosť liečby prostredníctvom nových typov imunoterapie, či už imunoterapie samotnej alebo v kombinácii s inými typmi štandardne používaných liečebných postupov, preukázali výrazný posun v úspešnosti liečby malígneho melanómu a nemalobunkového karcinómu pľúc. Predbežné správy z mnohých v súčasnosti prebiehajúcich štúdií, ktoré sa snažia aplikovať podobný typ liečby aj na iné nádorové ochorenia so zlou prognózou a nízkou dobou prežívania, indikujú pozitívnu klinickú odpoveď aj u týchto pacientov. Špičkovým vedeckým akademickým a klinickým pracoviskám sa postupne darí dekódovať obranné mechanizmy rakovinových buniek a jednotlivé signálne dráhy v rakovinových bunkách, ktoré im zabezpečujú únik spod kontroly imunitného systému. 

Identifikácia nových biomarkerov prostredníctvom budúcich rýchlo sa rozvíjajúcich technológií by mala zabezpečiť správne načasovanie a špecifickú indikáciu liečby pre každého pacienta s maximálnym účinkom a minimálnymi nežiaducimi vedľajšími účinkami. Navyše, aplikácia autológnych bunkových vakcín zabezpečí aktiváciu imunitného systému a stimuláciu špecifickej protinádorovej imunity voči nádorovým antigénom, ktoré sú exprimované rakovinovými bunkami pacienta v reálnom čase.

Výsledky vedeckých a klinických štúdií prezentované na svetových onkologických fórach a sympóziách poukazujú na to, že v najbližších rokoch by mal nastať významný prelom v liečbe rakoviny, čo určite najviac ocení onkologický pacient. 

Z tieňa týchto nadmieru pozitívnych správ sa však vynára poznámka, ktorá zaznela na European Cancer Congress 2015 vo Viedni organizovanom Európskou asociáciou pre výskum rakoviny, a to počas diskusie, po prezentácii excelentných výsledkov dosiahnutých počas imunoterapie s použitím inhibítorov imunitných kontrolných bodov: 

„Prezentované výsledky jasne preukazujú, že lekári by sa mali v blízkej budúcnosti pripraviť na súbežnú aplikáciu niekoľkých foriem účinnej inovatívnej liečby rakoviny. Otázkou však ostáva, či sú aj zdravotné poisťovne pripravené na to, aby zvládli takúto aj keď úspešnú, ale finančne veľmi nákladnú liečbu...“ 

Vzhľadom na neustále stúpajúci výskyt onkologických ochorení nám neostáva nič iné ako veriť, že áno.

 

 


Slovník pojmov 

Apoptóza – neimunogénna programovaná bunková smrť vedúca k navodeniu tolerancie voči uvoľneným bunkovým antigénom alebo bez aktivácie imunitného systému.

Dendritické bunky – profesionálne bunky prezentujúce antigén, kľúčové pre iniciáciu a moduláciu T bunkových imunitných odpovedí in vivo; dokážu účinne aktivovať antigén špecifické cytotoxické T bunky a produkciu protilátok závislú od T buniek, ale na druhej strane sú schopné navodiť imunologickú toleranciu. Ide o jedinú populáciu buniek imunitného systému, ktorá je schopná aktivovať naivné T bunky a stimulovať primárnu imunitnú odpoveď. 

Imunitné kontrolné body – inhibičné dráhy regulujúce stimulované získané imunitné odpovede.

Imunogénna bunková smrť – typ bunkovej smrti, ktorá je schopná spôsobiť lokálny zápalový proces, aktivovať imunitný systém voči antigénom, ktoré sú uvoľňované z umierajúcich buniek a vyvolať silné antigén špecifické imunitné odpovede.

Immunosupresia – znížená funkcia imunitného systému a jeho schopnosti reagovať voči signálom indikujúcim nebezpečenstvo, poškodenie tkanív, infekciu alebo nádorové ochorenie.

Krížová prezentácia antigénu (cross-priming) – schopnosť dendritických buniek internalizovať exogénne antigény, proteíny alebo bunky, a prezentovať takto získané antigény/epitopy prostredníctvom molekúl oboch tried MHC.  

Nádorové mikroprostredie – heterogénny systém buniek aktívne  sa zúčastňujúcich v procese progresie nádorového ochorenia, vytvorený rakovinovými bunkami a inými rôznymi populáciami nemalígnych buniek vrátane buniek imunitného systému, stromálnymi bunkami, nádorovo asociovanými fibroblastami, vaskulárnymi a lymfatickými endoteliálnymi bunkami.

Nádorové neoantigény – vysokošpecifické proteínové sekvencie, ktoré vznikajú zo zmutovaných proteínov počas nádorovej progresie.

Nádorovo asociované antigény – nádorové biomarkery pre rakovinové bunky. Veľký počet mutácií v rakovinových bunkách vedie k zmenám v produkcii proteínov špecifických pre malígne bunky, ktoré za normálnych podmienok nie sú v zdravej bunke exprimované. 

Nádorovo asociované M2 makrofágy – podskupina alternatívne aktivovaných M2 makrofágov s výraznými protumorigénnymi vlastnosťami. Pôsobia pri oprave poškodených tkanív a tvorbe nových extracelulárnych matrix, angiogenéze a produkciou imunosupresívnych faktorov výrazne zvyšujú migráciu regulačných T buniek do nádorového mikroprostredia.

Myeloidné bunky – bunky diferencujúce zo spoločných myeloidných prekurzorov pochádzajúcich z hematopoietických kmeňových buniek v kostnej dreni.

Myeloidné supresorové bunky  – heterogénna populácia myeloidných bunkových prekurzorov a nezrelých myeloidných buniek, ktorá zvyčajne za normálnych podmienok nie je v organizme prítomná. Ich zvýšený výskyt priamo súvisí s patologickým stavmi, ktoré vznikajú počas chronických zápalových procesov vrátane nádorového ochorenia. Za normálnych podmienok myeloidné bunkové prekurzory a nezrelé myeloidné bunky diferencujú na zrelé myeloidné bunky – makrofágy, granulocyty a dendritické bunky. Počas nádorovej progresie ich počet dramaticky narastá a bunky získavajú silné imunosupresívne vlastnosti so zníženou schopnosťou diferencovať sa na zrelé myeloidné bunky.

Šaperón – proteín, ktorý pomáha iným makromolekulovým štruktúram vrátane proteínov pri skladaní (zbaľovaní) sa do správnej (najstabilnejšej a úplne funkčnej) štruktúry.

 


Literatúra

1. World Cancer Report 2014 (IARC, 2014).
2. Hanahan, D. & Weinberg, R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144, 646 – 74 (2011).
3. Vesely, M.D., Kershaw, M.H., Schreiber, R.D. & Smyth, M.J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annu Rev Immunol 29, 235 – 71 (2011).
4. Schreiber, R.D., Old, L.J. & Smyth, M.J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science 331, 1565 – 70 (2011).
5. Lindau, D., Gielen, P., Kroesen, M., Wesseling, P. & Adema, G.J. The immunosuppressive tumour network: myeloid-derived suppressor cells, regulatory T cells and natural killer T cells. Immunology 138, 105 – 15 (2013).
6. Gabrilovich, D.I., Ostrand-Rosenberg, S. & Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nat Rev Immunol 12, 253 – 68 (2012). 
7. Campbell, D.J. & Koch, M.A. Phenotypical and functional specialization of FOXP3+ regulatory T cells. Nat Rev Immunol 11, 119 – 30 (2011).
8. Ruffell, B. & Coussens, L.M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell 27, 462 – 72 (2015).
9. Roychoudhuri, R., Eil, R.L. & Restifo, N.P. The interplay of effector and regulatory T cells in cancer. Curr Opin Immunol 33, 101 – 11 (2015).
10. Strioga, M. et al. Dendritic cells and their role in tumor immunosurveillance. Innate Immun (2012).
11. Palucka, K. & Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer 12, 265 – 77 (2012).
12. Galluzzi, L. et al. Classification of current anticancer immunotherapies. Oncotarget 5, 12472 – 508 (2014).
13. Schlom, J. et al. Therapeutic cancer vaccines. Adv Cancer Res 121, 67 – 124 (2014).
14. Garg, A.D., Martin, S., Golab, J. & Agostinis, P. Danger signalling during cancer cell death: origins, plasticity and regulation. Cell Death Differ 21, 26 – 38 (2014).
15. Lopez, J., Harris, S., Roda, D. & Yap, T.A. Precision Medicine for Molecularly Targeted Agents and Immunotherapies in Early-Phase Clinical Trials. Transl Oncogenomics 7, 1 – 11 (2015).
16. Mahoney, K.M., Rennert, P.D. & Freeman, G.J. Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets. Nat Rev Drug Discov 14, 561 – 84 (2015).
17. Martens, A. et al. Baseline peripheral blood biomarkers associated with clinical outcome of advanced melanoma patients treated with ipilimumab. Clin Cancer Res (2016).
18. Yuan, J. et al. Novel technologies and emerging biomarkers for personalized cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 4, 3 (2016).
19. Pol, J. et al. Trial Watch: Immunogenic cell death inducers for anticancer chemotherapy. Oncoimmunology 4, e1008866 (2015).
20. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L. & Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell 28, 690 – 714 (2015).
21. Green, D.R., Ferguson, T., Zitvogel, L. & Kroemer, G. Immunogenic and tolerogenic cell death. Nat Rev Immunol 9, 353 – 63 (2009).
22. Wolchok, J.D. et al. Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin Cancer Res 15, 7412 – 20 (2009).

Hodnotenie článku

inVitro 1/2016

Onkológia

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 1/2016 Onkológia. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro