V celosvetovom priemere bol zaznamenaný nárast infekcií vyvolaných chlamýdiami a mykoplazmami. Zvýšený výskyt ochorení potvrdzujú i naše laboratórne štatistiky.

Sú to baktérie, ktoré žijú vo vnútri ľudských buniek, poznáme ich viac druhov, ale dôležité sú najmä dve skupiny:

• jedny vyvolávajú infekcie močovo-pohlavného a reprodukčného systému, 
• druhé postihujú najmä horné a dolné dýchacie cesty. 

Infekcie vyvolané pôvodcom Chlamydia trachomatis sa považujú za najbežnejšie spomedzi všetkých sexuálne prenosných chorôb. Diagnostika a liečba chlamýdiovej infekcie je náročnejšia, pretože vo väčšine prípadov prebieha skryto, bez väčších viditeľných príznakov. Mykoplazmy a ureaplazmy sú po chlamýdiách najčastejšími kolonizátormi urogenitálneho traktu človeka. Tieto patogény sa dávajú do súvislosti s akútnou uretritídou u mužov a vaginitídou a cervicitídou u žien. Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum sú často diagnostikované u žien bez príznakov ochorenia. Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia pneumoniae sú kauzálnymi agensami pri infekciách horných i dolných dýchacích ciest, často s asymptomatickým alebo miernym priebehom.

Včasná laboratórna diagnostika týchto pôvodcov ochorení, liečba a kontrola infekcií vrátane preventívnych opatrení vyžadujú sústavný výskum a skúmanie klinických a epidemiologických súvislostí.

Metódy diagnostiky

Metódy priamej diagnostiky sú založené na dôkaze daného mikroorganizmu vo vzorke odobranej priamo z miesta predpokladanej infekcie. Keďže ide o mikroorganizmy s náročnými kultivačnými podmienkami, kultivácia sa v bežných laboratórnych podmienkach nevyužíva. Metódy priameho dôkazu sú preto založené na dôkaze antigénu alebo DNA. Rozhodujúcim faktorom pri metódach priameho dôkazu je kvalita odobranej vzorky. Je to obzvlášť významné pri chlamýdiách, keďže ide o intracelulárne mikroorganizmy, a preto je dôležité, aby vzorka obsahovala epiteliálne bunky. Vzorky obsahujúce len sekréty a exudáty nemusia byť pre správnu diagnostiku postačujúce. Týmito metódami je možné detegovať aj mŕtve mikroorganizmy, ktoré môžu byť prítomné vo vzorke po ukončení terapie, kým nie sú eliminované imunitným systémom. Kontrolné odbery po liečbe je preto vhodné urobiť minimálne s 3-týždňovým odstupom.

Nepriama diagnostika je založená na dôkaze protilátok v sére rôznymi imunologickými metódami. 

Chlamydia trachomatis

Priama diagnostika:

• dôkaz antigénu Ch. trachomatis – imunochromatografickou metódou (na žiadanke Klinická mikrobiológia I),
• dôkaz DNA Ch. trachomatis – PCR metódou (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

Priama diagnostika sa používa predovšetkým pri predpokladaní akútneho štádia infekcie, keď je pozitívny nález DNA Ch. trachomatis jednoznačným dôkazom infekcie. Rozdiel medzi 2 uvedenými metódami dostupnými v Alpha medical je v senzitivite aj špecificite stanovení. Vyššiu senzitivitu aj špecificitu má dôkaz DNA PCR metódou. Pri tejto metóde dosahuje špecificita 98 – 100 % a senzitivita je 96 – 100-percentná (pri koncentrácii Ch. trachomatis 5 – 10 IFU/ml). Stanovenie antigénu je imunochromatografický rýchlotest, pri ktorom je potrebné počítať s možnosťou tak falošnej pozitivity, ako aj negativity. Uvedeným rýchlotestom nie je možné rozlíšiť jednotlivé druhy chlamýdií (Ch. trachomatis, Ch. pneumoniae, Ch. psittaci), ak by boli prítomné v odobranej vzorke.

Typy vzoriek vhodných na uvedené vyšetrenia:

• výter z cervixu, výter z vagíny, výter z uretry – možné vyšetriť obidvoma metódami,
• moč, výter zo spojivkového vaku – možné vyšetriť len metódou PCR, stanovenie antigénu Chl. trachomatis v moči bolo v našich laboratóriách zrušené, preto už nie je uvedené na nových typoch žiadaniek. 

Dôležité podmienky správneho odberu vzoriek: 

• pred výterom z cervixu zotrieť hlien z cervixu a tento tampón vyhodiť, samotný odber realizovať druhým tampónom,
• pred výterom z uretry alebo odberom moču pacient nesmie minimálne 1 – 2 hodiny močiť,
• najvhodnejšie je odobrať prvý prúd ranného moču, do laboratória sa nesmie zaslať 1 vzorka určená zároveň na kultiváciu (treba stredný prúd moču) a na dôkaz Ch. trachomatis (treba prvý prúd moču),
• minimalizovať skladovanie natívneho moču pri laboratórnej teplote (pred jeho prenesením do transportnej skúmavky s cobas PCR médiom). 

Nepriama diagnostika: 

• stanovenie protilátok proti Ch. trachomatis IgM, IgA, IgG (skríningové vyšetrenie) metódou ELISA (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov),
• stanovenie protilátok proti Chlamydia spp. IgA, IgG (konfirmačné vyšetrenie) metódou Line Blot – v jednom stanovení sa detegujú protilátky proti Ch. trachomatis, Ch. pneumoniae a je možné detegovať aj protilátky proti Ch. psittaci (každý druh osobitne) (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

Nepriame sérologické metódy majú obmedzenú diagnostickú hodnotu pri povrchových infekciách slizníc urogenitálneho traktu a spojivky, keďže protilátková odpoveď je v týchto prípadoch oneskorená a nemusí byť dostatočne výrazná. Významný vzostup koncentrácie protilátok sa dá očakávať len pri systémových chlamýdiových nákazách. Sérologická diagnostika v prvých týždňoch infekcie nie je vhodná. IgM protilátky by sa mali vytvárať po 2 – 4 týždňoch od infikovania. IgM protilátky proti Ch. trachomatis – ako známka primoinfekcie – sa spravidla nevytvoria pri reinfekcii, ale často sa nemusia vytvoriť ani pri primoinfekcii Ch. trachomatis u pacientov s prekonanou infekciou Ch. pneumoniae. IgG protilátky sa vytvárajú po 3 – 4 týždňoch od infekcie, pozitivita IgG protilátok indikuje infekciu v neznámom čase, pretože trieda IgG protilátok môže perzistovať celý život, pričom tieto protilátky nemajú protektívny charakter. Predlžovanie času diagnostiky je pre odber párových vzoriek séra (2 – 3 týždne) z hľadiska liečby pacienta nevhodné. IgA protilátky sa tvoria zvyčajne po 4 týždňoch od infikovania, po liečbe antibiotikami by mali postupne vymiznúť do 6 mesiacov. IgA protilátky bývajú zvýšené pri chronickej infekcii. Nešpecifické IgA reakcie sa môžu vyskytnúť pri akútnej EBV infekcii v dôsledku polyklonálnej stimulácie B lymfocytov.

Rozdielne zloženie antigénov obsiahnutých v rôznych ELISA súpravách môže spôsobovať rozdielne výsledky, zvlášť pri nižších hladinách protilátok. Preto je v našich laboratóriách možné využiť konfirmačné stanovenie metódou Line Blot, ktorou sa zisťuje reaktivita protilátok s jednotlivými antigénmi chlamýdií. Konfirmačné stanovenie protilátok metódou Line Blot nerobíme automaticky, ale len v tom prípade, ak je na žiadanke osobitne požadované a v skríningovom vyšetrení zistíme pozitivitu protilátok proti chlamýdiám (Ch. trachomatis alebo Ch. pneumoniae) aspoň v jednej triede (IgM, IgA alebo IgG).

Dominantný chlamýdiový antigén je druhovo špecifický MOMP antigén (povrchový membránový proteín). Jednotlivé druhy chlamýdií majú z 25 – 35 % rozdielne aminokyselinové zloženie MOMP antigénov, čo vytvára predpoklady na odlíšenie jednotlivých druhov chlamýdií. Je to však spoľahlivé len pri infekcii jedným chlamýdiovým druhom. Pri koinfekcii viacerými druhmi môže dochádzať ku skríženej reaktivite protilátok proti MOMP antigénu aj pri metóde Line Blot. Na blote sú preto obsiahnuté aj ďalšie antigény: OMP2 (druhovo špecifický povrchový membránový proteín), HSP60 (Heat Shock proteín) – je markerom chronického zápalu a prítomnosť protilátok tohto typu býva asociovaná s infertilitou a reaktívnou artritídou a MIP antigén (Macrophage infectivity potentiator) – povrchový faktor virulencie u intracelulárnych mikroorganizmov. Protilátky proti jednotlivým antigénom majú v rámci kvalitatívneho hodnotenia blotu rôzny význam. Vzhľadom na vysokú prevalenciu infekcie Ch. pneumoniae v populácii býva interpretácia sérologického vyšetrenia protilátok pri infekcii Ch. trachomatis často náročná. 

Typy vzoriek vhodných na uvedené vyšetrenia:

• natívna venózna krv,
• sérum.

Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum

Priama diagnostika:

• kultivačné vyšetrenie M. hominis a U. urealyticum so stanovením citlivosti na antibiotiká – identifikačný kultivačný test založený na rozdielnych metabolických vlastnostiach a prirodzenej rezistencii mykoplaziem (na žiadanke Klinická mikrobiológia I),
• dôkaz DNA M. hominis – metódou PCR,
• dôkaz DNA M. genitalium – metódou PCR,
• dôkaz DNA U. urealyticum – metódou PCR. 

Vyšetrenia metódou PCR sú uvedené na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov.

Kultivačné vyšetrenie poskytuje možnosť semikvantitatívneho hodnotenia a pri pozitívnom náleze zároveň poskytuje informáciu o citlivosti na antibiotiká. Vyžaduje odber do špeciálneho transportného média, z ktorého nie je možné realizovať iné kultivačné vyšetrenia. Výsledky kultivačného vyšetrenia sú k dispozícii do 2 – 3 dní. DNA jednotlivých mykoplaziem metódou PCR je možné vyšetriť z tej istej vzorky ako DNA Ch. trachomatis. Nevýhodou PCR stanovenia v porovnaní s kultivačným vyšetrením je zbieranie série vzoriek pre 1 PCR analýzu, takže v štandardnom režime sú výsledky k dispozícii do 5 – 7 dní. 

Typy vzoriek vhodných na uvedené vyšetrenia:

• výter z cervixu
• výter z vagíny
• výter z uretry, moč – možné vyšetriť obidvoma metódami.

Dôležité podmienky správneho odberu vzoriek: 

• podmienky sú rovnaké ako tie, ktoré sú uvedené pri priamych metódach dôkazu Ch. trachomatis.

Nepriama diagnostika:

• pri diagnostike urogenitálnych mykoplaziem sa nevykonáva.

Chlamydia pneumoniae

Priama diagnostika:

• dôkaz DNA Ch. pneumoniae – PCR metódou (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

Priama detekcia DNA Ch. pneumoniae by mala byť zlatým štandardom v diagnostike akútnych ochorení vzhľadom na to, že existuje „sérologické okno“ (oneskorená protilátková odpoveď) v prvých týždňoch chlamýdiovej infekcie. PCR metódou je možné detegovať DNA Ch. pneumoniae z neinfekčných retikulárnych teliesok, ako aj z neživých elementárnych teliesok. Odber vzorky z najvhodnejšieho miesta (podľa typu infekcie) a kvalita odobranej vzorky majú rozhodujúci vplyv na správnosť diagnostiky. Pozitívny výsledok je jasným dôkazom infekcie, negatívny výsledok znamená neprítomnosť chlamýdií v odobranej vzorke, ale nemôže vylúčiť chlamýdiovú infekciu v celom organizme.

Typy vzoriek vhodných na uvedené vyšetrenie:

• výter z nazofaryngu, aspirát z nazofaryngu – pri infekcii horných dýchacích ciest, 
• spútum, bronchoalveolárna laváž – pri infekcii dolných dýchacích ciest,
• krv odobraná do EDTA môže pomôcť pri diagnostike systémovej chlamýdiovej infekcie, keď môže dochádzať k perzistencii chlamýdií v monocytoch a makrofágoch, nie je vhodná pri akútnych infekciách dýchacích ciest,
• synoviálna tekutina pri dôkaze chlamýdií u pacientov s reaktívnou artritídou.

Dôležité podmienky správneho odberu vzoriek: 

• pri výtere z nazofaryngu cez ústnu dutinu je dôležité zasunúť zahnutý tampón za zadný okraj mäkkého podnebia, zotrieť sliznicu v klenbe nazofaryngu vejárovitým pohybom tampónu a 5 sekúnd podržať tampón v nazofaryngu, aby sa absorboval aj sekrét,
• pri výtere z nazofaryngu cez nosovú dutinu treba jemným skrutkovitým pohybom zaviesť tampón cez nosovú dutinu do nazofaryngu (až kým nezaznamenáte odpor), jemne a pomaly rotovať tampónom v nazofaryngu 5 sekúnd, aby sa absorboval aj sekrét,
• na výter z nosa alebo z tonzíl sú materiály, pri ktorých je potrebné počítať s vyšším percentom falošnej negativity, a preto ho v našom laboratóriu neodporúčame na diagnostiku Ch. pneumoniae.

Nepriama diagnostika:

• stanovenie protilátok proti Ch. pneumoniae IgM, IgA, IgG (skríningové vyšetrenie) metódou ELISA (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov),
• stanovenie protilátok proti Chlamydia spp. IgA, IgG (konfirmačné vyšetrenie) metódou Line Blot – v jednom stanovení sa detegujú protilátky proti Ch. trachomatis a Ch. pneumoniae a je možné detegovať aj protilátky proti Ch. psittaci (každý druh osobitne) (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

Pri infekcii Ch. pneumoniae dochádza k vzostupu IgM protilátok až po 3 – 4 týždňoch po infikovaní, pri reinfekcii sa protilátky nemusia vytvoriť vôbec. IgG protilátky sú pozitívne 6 – 8 týždňov po infikovaní, rýchlejší vzostup IgG protilátok je pri reinfekciách (1 – 3 týždne od reinfekcie). Po prekonaní infekcie Ch. pneumoniae pretrváva pozitivita IgG protilátok zvyčajne 3 – 5 rokov po prvej infekcii, pri reinfekciách dlhšie než 5 rokov. Polčas rozpadu IgA protilátok je kratší než IgG protilátok, a preto sa pozitivita IgA protilátok považuje za najlepší ukazovateľ perzistujúcej infekcie. V dospelej populácii však býva často zisťovaná vysoká prevalencia nielen IgG protilátok, ale aj IgA protilátok, čo môže byť spôsobené nielen perzistenciou infekcie, ale aj opakovanými expozíciami Ch. pneumoniae. Naopak, u malých detí mladších než 5 rokov sa pozitivita protilátok proti Ch. pneumoniae zaznamenáva zriedkavo, čo môže byť spôsobené slabou antigénnou stimuláciou alebo nezrelosťou imunitného systému.

Konfirmačné stanovenie protilátok metódou Line Blot nerobíme automaticky, ale len v tom prípade, ak je na žiadanke osobitne požadované a v skríningovom vyšetrení zistíme pozitivitu protilátok proti chlamýdiám (Ch. trachomatis alebo Ch. pneumoniae) aspoň v jednej triede (IgM, IgA alebo IgG). Konfirmačné stanovenie má význam pri dlhodobej perzistencii protilátok proti chlamýdiám a môže pomôcť rozlíšiť infekciu Ch. pneumoniae a Ch. trachomatis. Aj napriek tomu, že na blote sa detegujú protilátky proti 4 proteínom vonkajšej membrány Ch. pneumoniae (MOMP, OMP2, OMP4, OMP5), môže byť rozlíšenie protilátok proti Ch. pneumoniae a Ch. trachomatis veľmi problematické. Hraničná reaktivita protilátok s antigénmi Ch. pneumoniae zvyčajne znamená prítomnosť zvyškových protilátok z predchádzajúcej infekcie. Vzostup protilátok proti Ch. pneumoniae sa môže často pozorovať aj v prípade primoinfekcie Ch. trachomatis. Protilátky proti OMP2 antigénom sú často pôvodcami skrížených reaktivít. V prípade reaktivity obidvoch OMP2 antigénov (Ch. trachomatis aj Ch. pneumoniae) je možné rozlíšiť infekciu podľa reaktivity s MOMP antigénom. V prípade infekcie Ch. pneumoniae však môžu protilátky proti MOMP antigénu chýbať, negativita MOMP protilátok sa zvyčajne nevyskytuje pri infekcii Ch. trachomatis. 

Mycoplasma pneumoniae

Priama diagnostika: 

• dôkaz DNA M. pneumoniae – PCR metódou (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

Kultivácia mykoplaziem je na štandardnú diagnostiku nevhodná, pretože mykoplazmy rastú veľmi pomaly a kolónie bývajú viditeľné až po 2 – 5 týždňoch kultivácie. Priamy dôkaz DNA metódou PCR je preto vhodnou alternatívou, keďže umožňuje získať výsledky rýchlo (v našom laboratóriu sú k dispozícii spravidla do 2 – 3 dní). PCR metóda je vysoko senzitívna a špecifická. Veľký vplyv na správnu diagnostiku má – rovnako ako pri chlamýdiách – typ a kvalita vzorky. Pravdepodobnosť záchytu mykoplaziem sa môže zvýšiť zaslaním 2 vzoriek rôznej lokalizácie. V štádiu infekcie, keď dôjde k vzostupu IgG protilátok, už môže byť vzorka z horných dýchacích ciest negatívna na DNA M. pneumoniae, to však nevylučuje infekciu v dolných dýchacích cestách.

Typy vzoriek vhodných na uvedené vyšetrenie:

• výter z nazofaryngu, výter z hrdla, aspirát z nazofaryngu – pri infekcii horných dýchacích ciest,
• spútum, bronchoalveolárna laváž, endotracheálny aspirát – pri infekcii dolných dýchacích ciest.

Dôležité podmienky správneho odberu vzoriek:

• výter z nazofaryngu možno urobiť cez ústnu alebo nosovú dutinu; pokyny k správnemu odberu sú uvedené vyššie pri dôkaze DNA Ch. pneumoniae,
• výter z nazofaryngu je vhodné doplniť výterom z tonzíl,
• pri výtere z tonzíl treba dôsledne zotrieť sliznicu tonzíl skrutkovitým otáčaním odberového tampónu, pričom treba tampón posúvať dopredu a dozadu a potom zhora nadol; u pacientov po tonzilektómii treba vykonať výter zo zadnej steny faryngu, 
• u detí sa odporúča hlavne výter z nazofaryngu a výter z tonzíl, u dospelých spútum.

Nepriama diagnostika:

• stanovenie protilátok proti M. pneumoniae IgM, IgA, IgG (skríningové vyšetrenie) metódou ELISA (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov), 
• stanovenie protilátok proti M. pneumoniae IgM, IgA, IgG (konfirmačné vyšetrenie) metódou Line Blot (na žiadanke Infekčná sérológia, dôkaz DNA mikroorganizmov).

K vzostupu IgM protilátok dochádza už týždeň po infikovaní, ale zvyčajne len pri primoinfekcii M. pneumoniae. Stanovenie IgM má preto najvýpovednejšiu hodnotu u detí v predškolskom veku. Pri reinfekcii je pozitivita IgM zaznamenaná len zriedkavo. V prípade, že pri reinfekcii dôjde k vzostupu IgM protilátok, môže táto pozitivita pretrvávať dlhodobo, pričom takýto dlhodobý nález nekoreluje s klinickým stavom pacienta. IgG protilátky sa pri primoinfekcii objavujú 2 – 3 týždne po vzostupe IgM, pri reinfekcii je vzostup rýchlejší. Prevalencia IgG protilátok proti Mycoplasma pneumoniae je u malých detí (mladších než 5 rokov) výrazne vyššia než prevalencia IgG protilátok proti Chlamydia pneumoniae. Najlepším ukazovateľom aktívnej infekcie sú IgA protilátky – vzhľadom na rýchly vzostup a najkratší polčas rozpadu v porovnaní s IgG aj IgM. Po prekonaní infekcie pretrváva pozitivita IgA protilátok najkratšie, pozitivita IgG protilátok môže pretrvávať mesiace až roky.

Protilátky proti M. pneumoniae sú namierené proti glykolipidom ich vonkajšej membrány, ktoré sú bežné aj u iných mikroorganizmov, čo môže viesť ku skríženým reakciám pri sérologickej diagnostike. Na minimalizovanie možnosti skríženej reaktivity slúži konfirmačné vyšetrenie protilátok metódou Line Blot, ktorou sa zisťuje reaktivita protilátok s jednotlivými antigénmi M. pneumoniae. Toto konfirmačné vyšetrenie nerobíme automaticky, ale len v tom prípade, ak je na žiadanke osobitne požadované a v skríningovom vyšetrení zistíme pozitivitu protilátok aspoň v jednej triede (IgM, IgA alebo IgG). V takomto prípade vyšetríme metódou Line Blot všetky triedy protilátok: IgM, IgA aj IgG. Vzhľadom na to, že Line Blot je vysokosenzitívna metóda, stáva sa, že zaznamenáme hraničný alebo aj pozitívny výsledok protilátok na blote aj v takom prípade, keď bola rovnaká trieda protilátok v skríningovom vyšetrení negatívna. V jednotlivých triedach protilátok je detegovaná vždy iná kombinácia protilátok proti 5 – 7 antigénom, pričom pre pozitívny výsledok je potrebné, aby boli prítomné protilátky minimálne proti 4 (pre IgM protilátky) až 5 antigénom (pre IgA protilátky). V triede IgG pretrvávajú najdlhšie protilátky proti P1-EPI antigénu. Pozitivita len anti P1- EPI IgG znamená, že pacient prekonal infekciu M. pneumoniae v dávnej minulosti. V takom prípade môžu byť IgG protilátky v skríningovom vyšetrení negatívne.

Záver

V závere je potrebné povedať, že správna diagnostika a včasná liečba chlamýdiových a mykoplazmatických infekcií je relatívne náročný proces, ktorý začína dôkladným odberom vhodného materiálu, pokračuje správnou voľbou vyšetrovacej metódy a náležitou interpretáciou výsledkov. Infekcie vyvolané popisovanými mikroorganizmami sa zaraďujú medzi takzvané atypické, ktoré môžu viesť až k poruche imunity a môžu postihnúť takmer každý orgán. Úspešná liečba vyžaduje dobrú spoluprácu nielen medzi pacientom a lekárom, ale aj diagnostikom v laboratóriu.