Pohľad na úlohu patológa v diagnostike kolorektálneho karcinómu

Kolorektálny karcinóm (KRK) je už v súčasnosti považovaný za civilizačné ochorenie s významným socioekonomickým dopadom. Incidencia tohto novotvaru neustále stúpa a vo vyspelých krajinách predstavuje najčastejší zhubný novotvar GIT-u. Ide pravdepodobne o dôsledok moderného spôsobu života, kde sú významným negatívnym faktorom stravovacie návyky.

Jeho výskyt bol opísaný vo všetkých vekových skupinách, deti nevynímajúc. Zatiaľ čo v minulosti bol KRK ochorením prevažne starších ľudí vo veku nad 50 rokov, v posledných rokoch pozorujeme zvýšenú incidenciu tohto zhubného ochorenia u pacientov pred dovŕšením 40. roku života. Na základe histomorfológie rozoznávame niekoľko subtypov kolorektálneho karcinómu, ktoré sa vzájomne líšia aj na molekulárno-genetickej úrovni.

Podľa histologickej stavby samotného nádoru rozdeľujeme kolorektálny karcinóm na niekoľko typov (WHO klasifikácia):

  • adenokarcinóm,
  • mucinózny adenokarcinóm,
    Obrázok č. 1: Makrofotografia karcinómu hrubého čreva
    Obrázok č. 1: Makrofotografia karcinómu hrubého čreva
  • karcinóm z prstencových buniek („Signet ring“ cells),
  • skvamózny (dlaždicovo-bunkový) karcinóm,
  • adenoskvamózny karcinóm,
  • nediferencovaný karcinóm,
  • neklasifikovateľný karcinóm.

Približne 60 – 80 % KRK vzniká z morfologicky klasického adenómu prostredníctvom konvenčnej supresorovej dráhy karcinogenézy a vyznačuje sa statusom mikrosatelitovej stability (MSS), respektíve chromozómovej nestability (CIN). Veľká časť zostávajúcich karcinómov vzniká zo „serátnych“ adenómov „serátnou“ dráhou karcinogenézy a je charakterizovaná zvýšenou frekvenciou metylácie CpG ostrovčekov (CIMP), pričom časť z nich je mikrosatelitovo nestabilná (MSI-H). Makroskopicky môže byť rast kolorektálneho karcinómu polypoidný, ulcerózny a difúzny (tzv. skirhus). Pri diagnostike karcinómov treba u pacientov mladších než 40 rokov zvážiť genetickú predispozíciu aj v takých prípadoch, keď je rodinná anamnéza negatívna.

Dokázať dedičnú záťaž sa darí v asi 20 % prípadov. Zvyčajne ide o pacientov s familiárnou polypózou, juvenilnou polypózou, Peutzovým-Jeghersovým syndrómom a hereditárnym nepolypoidným karcinómom. Defekty v týchto génoch môžu vznikať de novo alebo ako dôsledok čerstvej mutácie. O prekancerózu ide aj u adenómov, kde riziko malígnej transformácie stúpa úmerne so stupňom dysplázie a veľkosti polypu. Všeobecne platí, že polypy so široko nasadajúcou bázou sú rizikovejšie než stopkaté. Rovnaké riziko predstavujú aj zápalové ochorenia hrubého čreva a to predovšetkým ulcerózna kolitída a Crohnova choroba.

Vo veľkej väčšine prípadov ide o sporadický karcinóm (aj keď samotný nádor môže obsahovať defektný gén, ktorý je typický pre vrodené syndrómy). Jeho vznik sa dáva do súvislosti so zlým životným štýlom, predovšetkým v dôsledku zlých stravovacích návykov a zloženia stravy (nadmerný príjem živočíšnych tukov, konzumácia tzv. červeného mäsa a údenín).

Karcinogenéza kolorektálneho karcinómu

Z pohľadu patogenézy môžeme KRK rozdeliť na také, ktoré vznikajú na podklade vrodenej mutácie a tvoria súčasť vrodených karcinómových syndrómov, nasledujú také, ktoré vznikajú na podklade chronického zápalového poškodzovania sliznice v rámci dlhotrvajúceho IBD („inflammatory bowel disease“) a poslednú – a najväčšiu – skupinu reprezentujú sporadické karcinómy.

Pri objasňovaní procesu karcinogenézy KRK bola doteraz pozornosť upriamená predovšetkým na epitelovú zložku nádoru. Dnes sa už začína uvažovať aj o význame mikroprostredia ako o významnom prognostickom ukazovateli, ktorý ovplyvňuje nádorový rast, ako sú napríklad intratumorálne lymfocyty, ktoré sú súčasťou strómy tumoru.

Pri premene adenómu na KRK sa na molekulárno-biologickej úrovni odohrávajú morfologické zmeny podmienené sériou genetických zmien vedúcich k mutácii alebo delécii kľúčových tumor supresorových génov a protoonkogénov. Prvotnou genetickou aberáciou v tejto konvenčnej dráhe je inaktivácia APC génu, ktorá je nasledovaná mutáciou génu KRAS a neskôr aj inaktiváciou Tp53 tumor supresorového génu. 

Pre karcinómy vznikajúce touto cestou karcinogenézy je charakteristický stav aneuplodity, respektíve strata heterozygozyty, ktorá je podmienená chromozómovou nestabilitou (CIN). Tým rozumieme závažnú genetickú alteráciu, ktorá vedie zmenám v štruktúre alebo počte chromozómov v zmysle delécie, inzercie alebo translokácie čo zohráva významnú úlohu v progresii adenómu do karcinómu. Týmto spôsobom vzniká 60 – 80 % KRK, pričom väčšina z nich je lokalizovaná v ľavom kolóne a rekte a má morfológiu konvenčného adenokarcinómu NOS.

Včasný konvenčný adenóm

U adenómov sa za prvotnú morfologicky detegovateľnú neoplastickú zmenu považujú aberantné krypty ako istá forma mikroadenómov. Z časti týchto aberantných krýpt potom vznikajú tzv. včasné tubulárne adenómy s ľahkým stupňom dysplázie (intraepitelovej neoplázie). U týchto prekurzorov a u hyperplastických polypov, ako aj pri 70 – 80 % prípadov KRK bola detegovaná mutácia APC génu, z čoho vyplýva, že narušenie jeho funkcie zohráva významnú úlohu v iniciálnej fáze karcinogenézy. Táto mutácia však sama o sebe k malígnej transformácii nepostačuje. Tomu nasvedčuje aj fakt, že väčšina adenómov neprogreduje do karcinómu.

„Prechodový“ alebo tzv. intermediate adenóm

Medzistupňom medzi včasným a pokročilým adenómom je tzv. prechodový adenóm. Morfologicky ide prevažne o adenómy, ktoré majú veľkosť do 1 cm a v ich architektonike sa objavuje tzv. vilózna zložka a ktoré nevykazujú viac než mierny stupeň dysplázie. Z genetického hľadiska sú tieto adenómy nositeľmi mutácií génu KRAS, ktoré sa vyskytujú pri asi 40 % KRK. KRAS proteín slúži ako prenášač externých signálov z transmembránovéhoreceptora epidermálneho rastového faktora (EGFR) do bunky a je súčasťou signálnej dráhy mitogén aktivujúcej proteínkinázy (MAPK), ktorá sa podieľa na regulácii proliferácie, diferenciácie, angiogenézy a bunkovej motility. 

Obrázok č. 2: Kolorektálny karcinóm – intestinálny typ
Obrázok č. 2: Kolorektálny karcinóm – intestinálny typ

V prípade mutovaného KRAS génu zostáva defektný proteín permanentne aktivovaný, čo vedie k nekontrolovanej bunkovej proliferácii a celkovej malígnej transformácii bunky. KRAS mutácia sa objavuje ešte pred vznikom aneuploidity, a teda chromozómovej nestability. To stavia danú genetickú zmenu do roviny akéhosi medzistupňa progresie adenómu. Raz získaná KRAS mutácia zostáva nezmenená a býva zachovaná počas celého „života“ nádoru vrátane metastáz.

Obrázok č. 3: Kolorektálny karcinóm – mucinózny typ
Obrázok č. 3: Kolorektálny karcinóm – mucinózny typ

Pokročilý adenóm

Ide o adenómy, ktoré sú väčšie než 1 cm, prevažne s vilóznou architektonikou a s vyšším stupňom dysplázie (intraepitelovej neoplázie – stredný a ťažký stupeň). Pre pokročilé adenómy je charakteristická strata heterozygozity deléciou dlhého ramienka 18. chromozómu (18q LOH), ktorá je prítomná v 60 – 70 % prípadov KRK. 

Za významnú genetickú zmenu odohrávajúcu sa v poslednej fáze kolorektálnej karcinogenézy je považovaná inaktivácia tumor supresorového génu Tp53, ktorý zohráva kľúčovú úlohu v regulácii bunkového cyklu a apoptózy a jeho mutácia vedie ku genómovej nestabilite a nekontrolovanej bunkovej proliferácii. 

Obrázok č. 4: Kolorektálny karcinóm – mucinózny typ
Obrázok č. 4: Kolorektálny karcinóm – mucinózny typ

Genetické zmeny v prekurzoroch KRK

Hyperplastické polypy

Predstavujú skupinu pomerne častých polypov a môžu vznikať v ktorejkoľvek časti hrubého čreva, avšak častejšie bývajú lokalizované v oblasti ľavého kolónu a rekta. Väčšina týchto polypov je menšia ako 5 mm, sú asymptomatické a sú zväčša náhodným nálezom pri kolonoskopii. Histomorfologicky rozlišujeme tri typy hyperplastických polypov: mikrovezikulárny, „goblet cell“ a „mucin poor“ hyperplastický polyp, avšak bez rutinného použitia v praxi. Z genetickej stránky bola pri týchto polypoch dokázaná mutácia BRAF a menej často mutácia KRAS génu, čo pravdepodobne poukazuje na prvotné zmeny v serátnej dráhe karcinogenézy.

Sesilné serátne adenómy (SSA) s a bez dysplázie

Tvoria asi 10 % spomedzi všetkých kolorektálnych polypov, ktoré bývajú predilekčne lokalizované v pravom kolóne. Morfologicky ide o sesilné polypy rôznej veľkosti s typickými architektonickými zmenami krýpt v spojitosti s poruchou maturácie epitelu, avšak bez prítomnosti dysplázie. Diagnostikovanie týchto polypov je zväčša problematické a často bývajú zamieňané za mikrovezikulárne hyperplastické polypy. 

Pri časti SSA dochádza k vzniku konvenčnej dysplázie a tieto lézie boli ešte nedávno označované ako zmiešané polypy (SSA + konvenčný adenóm). Nová štúdia však na základe genetickej analýzy potvrdila klonalitu týchto neoplázií a vyvrátila fakt, že by malo ísť o kompozitný tumor. Označenie sesilný serátny adenóm s dyspláziou (SSA-D) sa preto v súčasnosti javí ako adekvátne. 

Na molekulovo-genetickej úrovni bola pri SSA dokázaná častá mutácia BRAF génu, ktorá sa zdá kľúčová v iniciálnej fáze nádorového procesu. SSA – obzvlášť SSA s dyspláziou – sú považované za biologicky agresívne prekurzory s vysokým rizikom pomerne rýchlej malígnej transformácie a vyžadujú si kompletnú excíziu polypu s následným sledovaním pacienta s minimálne takou frekvenciou ako pri konvenčných adenómoch.

Tradičné serátne adenómy (TSA) 

Sú veľmi zriedkavé a predstavujú približne 1 % zo všetkých kolorektálnych polypov. Môžu vznikať v ktorejkoľvek časti hrubého čreva ale prevažne bývajú v rektosigme. Väčšina z týchto polypov je väčšia než 5 mm a je charakteristická tubulo-vilóznou architektonikou s typickou morfológiou epitelu, ktorý sa vyznačuje tzv. pilovaním. Z molekulovo-genetickej stránky môžu mať dané polypy mutovaný BRAF alebo KRAS gén.

Karcinómy vznikajúce serátnou dráhou karcinogenézy

Na základe uvedených genetických zmien (BRAF, KRAS, CIMP, MSI) môžeme KRK vznikajúce „serátnou“ dráhou karcinogenézy rozdeliť do troch skupín: 

  1. BRAF mutované, CIMP-H (metylovaný hMLH1) a MSI,
  2. BRAF mutované, CIMP-H (metylovaný MGMT, p16) a MSS,
  3. KRAS mutované, CIMP-LMSS.

Prvá skupina KRK je charakterizovaná prítomnosťou BRAF mutácie, CIMP-H (metylovaný hMLH1) a MSI-H. Tieto karcinómy vznikajú zo SSA a bývajú lokalizované v oblasti céka a kolon ascendens s častejšou incidenciou u starších žien. Tento typ karcinómu sa diagnostikuje prevažne v pokročilejšom štádiu. Vyznačuje sa však nízkou frekvenciou lokálnych metastáz a patrí k prognosticky priaznivým novotvarom. Morfologicky ide o mucinózne alebo nízko diferencované karcinómy s expanzívnym rastom a peritumorálnou a intratumorálnou zápalovou reakciou. Tieto morfologické znaky sú asociované s MSI pri sporadických formách KRK, ako aj v rámci Lynchovho syndrómu (LS). Identifikácia BRAF mutácie v tomto prípade vylúči možnosť LS. 

Druhá skupina má genetický profil charakterizovaný BRAF mutáciou, CIMP-H (metylovaný MGMT, p16) a MSS. Tieto karcinómy vznikajú taktiež zo SSA a rovnako bývajú častejšie lokalizované v oblasti pravého kolónu. Morfologicky ide opäť o mucinózne alebo zle diferencované konvenčné adenokarcinómy, časť karcinómov z prstencových buniek. Je pre nich typický infiltratívny rast a lymfovaskulárna invázia s častejším postihnutím lymfatických uzlín a s horšou prognózou.

Do tretej skupiny patria karcinómy s KRAS mutáciou, ktorých prekurzormi sú tradičné serátne a vilózne adenómy, ktoré majú tendenciu progredovať do mucinózneho adenokarcinómu alebo tzv. serátneho adenokarcinómu. Všeobecne sa vyznačujú horšou prognózou v porovnaní s konvenčným adenokarcinómom.

Mikrosatelitová nestabilita (MSI-H)

Adenokarcinómy s MSI-H predstavujú 10 – 15 % všetkých KRK a sú prevažne lokalizované v pravom kolóne. Stanovovanie MSI-H má niekoľko klinických významov. V prvom rade slúži ako skríningový marker pri pátraní po pacientoch s LS, vzhľadom na to, že viac než 90 % KRK je v rámci LS MSI

KRAS

Patrí do skupiny RAS protoonkogénov (spolu s NRASHRAS) a je súčasťou signálnej dráhy MAPK, na začiatku ktorej stojí EGF receptor. Mutácie KRAS génu sú považované za negatívny prediktívny marker liečby monoklonálnymi anti-EGFR protilátkami (cetuximab, panitumumab). V prípade nemutovaného KRAS génu sa v súčasnosti odporúča testovanie na prítomnosť mutácie ďalšieho z rodiny RAS onkogénov, a to NRAS génu, ktorý je mutovaný pri 2 – 10 % KRK. Aktivovaný KRAS podporuje bunkovú proliferáciu a vedie k supresii diferenciácie, kým aktivovaný NRAS potláča apoptózu vo vznikajúcom tumore. Ani KRAS, ani NRAS nie sú v súčasnosti považované za prognostické markery.

BRAF

Mutácia génu BRAF sa objavuje pri 10 – 20 % KRK a vedie k aberantnej aktivácii signálnej dráhy MAPK. BRAF mutácia je považovaná za negatívny prognostický faktor, ktorý vedie u pacientov s mutovaným BRAF KRK k signifikantne kratšiemu prežívaniu bez progresie oproti tým, ktorí majú BRAF nemutovaný. Na podklade niektorých štúdií je však negatívny prognostický efekt BRAF mutácie zmiernený v prítomnosti mikrosatelitovej nestability.

Základné imunohistochemické parametre KRK

Pozitívne markery: CK20, CDX2, villin.
Negatívne: CK7.
Protilátky na zistenie MSI: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2.
Pri MSI-H karcinómoch sa nemusí zistiť rekcia na CDX2 a/alebo CK20.

Záver

Dnešná moderná onkológia si pre stanovenie správnej liečby vyžaduje stále širšiu paletu prognostických ukazovateľov a prediktívnych faktorov. Preto sa aj patológia v poslednom období čoraz viac zameriava nielen na rutinné stanovenie diagnózy a základného stagingu, ale aj na diagnostiku týchto prediktívnych faktorov v spolupráci s genetickými pracoviskami. Zatiaľ čo parametre s vysokou prognostickou hodnotou (pTNM, vaskulárna invázia) sú hodnotené klasickým histomorfologickým vyšetrením, stanovovanie prediktívnych markerov je doménou molekulárno-genetického vyšetrenia. Dnes sú v našich podmienkach do klinickej praxe štandardne zavedené dva molekulovo-genetické testy zamerané na prítomnosť KRAS a NRAS mutácie, ale s rozvojom molekulárnej genetiky sa v blízkej budúcnosti škála týchto testov určite rozšíri. Aplikácia tejto širokej škály molekulárno-genetických informácií a ich postupná aplikácia do praxe bude mať úspech len za predpokladu adekvátnej klinicko-patologickej korelácie.

Hodnotenie článku

inVitro 3/2015

Genetika

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 3/2015 Genetika. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro