Testovanie autoprotilátok metódou nepriamej imunofluorescencie a technikou imunoblot

V Diagnostickom centre Patológie v Martine stanovujeme autoprotilátky v sére pacientov s rozličnými autoimunitnými poruchami, pričom ročne vyšetríme takmer 9 tisíc vzoriek sér. Využívame k tomu dve techniky, ktoré sú principiálne podobné a súčasne umožňujú principiálne odlišné interpretácie – metódu nepriamej imunofluorescencie (IF) a metódu imunoblot (IB). Inou možnou alternatívou je vyšetrenie tzv. biočipov. Sú to plastové mikročastice s prichyteným terčovým antigénom, na ktoré sa aplikuje sérum pacienta podobne ako na bunkový substrát alebo rezy tkanív.

Metóda nepriamej IF

Základné vyšetrenie autoprotilátok spočíva v ich počiatočnom skríningu, na ktorý sa používa metóda nepriamej IF. Antigénom pri najčastejšie požadovanom vyšetrovaní protilátok ANA sú bunky Hep-2. Pre väčšinu iných druhov autoprotilátok sa používajú fixované rezy z rozličných orgánov (pečeň, obličky, placenta, ováriá, stena žalúdka, ezofagus, mozoček a iné podľa aktuálnej potreby). Na detekciu autoprotilátok proti bunkám spermií sa používajú nátery buniek spermií fixované acetónom, kým na detekciu protilátok voči neutrofilným granulocytom sa používajú nátery polymorfonukleárnych leukocytov fixované v etylalkohole, ako aj v neutrálnom formalíne. Vo všeobecnosti platí, že pri metóde nepriamej IF sa na fixované bunky alebo rezy najprv aplikuje vyšetrované sérum pochádzajúce od pacienta. Po premytí a odstránení nezreagovaných protilátok sa na opláchnuté rezy aplikuje druhá označená protilátka (FITC), ktorá reaguje s ľudským imunoglobulínom v prvej vrstve. Pri pozitívnom výsledku skríningu na ANA v základnom riedení sa pristupuje k zisteniu titra autoprotilátky, ako aj jeho triedy. Pri titrácii sa zisťuje posledné riedenie, ktoré poskytuje zreteľne pozitívnu IF (najmenej 1:100) ako aj trieda imunoglobulínov, na ktoré je reakcia autoprotilátky viazaná pri základnom riedení (IgG, IgM a IgA).

Kedy sa odporúča vyšetrenie technikou IB

Test nepriamej imunofluoresecncie s použitím pacientovho séra je metóda, ktorá umožní vyšetriť veľké množstvo vzoriek. Ak je výsledok pozitívny, alebo ak sa z nejakej príčiny metódou IF nepotvrdí oprávnené klinické podozrenie, odporúčame vyšetriť sérum metódou imunoblot (IB). K vyšetreniu IB je možné použiť už zaslanú vzorku pacientovho séra. Vyšetrenie metódou IB býva potrebné aj na spresnenie alebo doplnenie výsledku IF testu. Pri technike IB sa používajú stripy (prúžky) zo špeciálnej nylonovej membrány, na ktorú boli predtým prichytené purifikované (obvykle rekombinantné) antigény (polypeptidy), proti ktorým by mohli byť namierené testované autoprotilátky. Stripy sa najskôr opláchnu v umývacom roztoku, potom sa na ne aplikuje testované sérum. Po predpísanej inkubácii, počas ktorej sa na antigén prichytia príslušné protilátky prítomné v sére, sa prúžky dôkladne opláchnu. Potom sa na ne aplikuje druhá protilátka označená enzýmom (obvykle peroxidáza alebo alkalická fosfatáza). Zreagovaný komplex antigénu a protilátky ostáva aj po opakovanom premytí pevne zachytený na prúžku, takže sa môže znázorniť špeciálnym reagens detegujúcim enzým konjugovaný na druhú protilátku. Vzhľadom na diagnostický význam presného určenia druhu autoprotilátky (namierenej proti jednotlivým dobre definovaným bielkovinám) odporúčame, aby príslušný lekár zasielajúci vzorku vyžadoval popri základnom vyšetrení séra metódou nepriamej IF aj jeho doplnkové vyšetrenie technikou IB. Najmä v prípadoch diferenciálnej diagnostiky je výhodou stripu možnosť dokázať súčasne autoprotilátky voči viacerým antigénom naraz, lebo jednotlivé reakčné produkty tvoria prúžky odlišnej hmotnosti viditeľné v rozličných reakčných pásmach stripu. Získa sa tak alternatívny výsledok k menej citlivému IF testu, čo môže byť dôležité najmä pri niektorých druhoch protilátok ANA.

popisok - Alt Text
Obr.: Popis metódy imunofluorescencie (A. nepriama imunofluorescencia, B. priama imunofluorescencia)

Determinanty tvorby autoprotilátok v organizme

Autoimunitné procesy vedúce k tvorbe autoprotilátok môžu byť vyvolané antigénmi infekčných agensov (niektoré vírusy a baktérie), ktoré majú epitopy (imunogénne peptidy) podobné niektorým antigénom tkanív alebo buniek (napodobňovanie antigénu, antigenic mimicry), takže vzniká skrížená protilátková odpoveď. Inokedy sa autoprotilátky tvoria v organizme (obvykle v závislosti od druhu molekúl HLA) pre poruchu fyziologického mechanizmu „vyraďovania“ tých T a B buniek, ktoré by mohli v budúcnosti rozpoznať príslušný antigén. Proces rozpoznania a selekcie telu vlastných antigénov sa uskutočňuje v týmuse. Treťou možnosťou tvorby autoprotilátok je odkrytie tzv. maskovaných (skrytých) antigénov, ktoré bežne neprichádzajú do styku s cirkulujúcimi bunkami imunitného systému. Avšak v neposlednom rade môže nastať zlyhanie inhibičnej funkcie regulačných T buniek (Treg), ktoré za určitých okolností prestanú plniť svoju tlmiacu funkciu v zápalovom procese.

Najčastejšie chorobné stavy s výskytom autoprotilátok

Autoprotilátky sa vyskytujú pri celom rade chorôb, ktoré sa vyznačujú niektorou zo zhora uvedených porúch vedúcich k poruche rozlišovania telu vlastných imunogénov od tých cudzorodých. Diagnostike pri takýchto stavoch napomáha detekcia autoprotilátok a súčasne (hoci iba čiastočne) vysvetľuje patogenézu autoimunitných ochorení. Medzi najčastejšie chorobné stavy s výskytom autoprotilátok patria:

  1. systémový lupus erythematosus a Sjögrenov syndróm (protilátky ANA proti niektorým zo 14 antigénov dokazovaných metódou imunoblot v stripe ANA),
  2. systémová skleróza (SSc) s tvorbou protilátok anti-Scl-70 (zo skupiny ANA) s možnosťou dôkazu 13 diagnosticky dôležitých antigénov odlišných od základného stripu ANA,
  3. dermatomyozitída a rozličné formy idiopatických imunitných myozitíd (IIM) s tvorbou niektorých protilátok zo skupiny ANA (anti-Jo-1), protilátok anti-MDA5, respektíve anti-SRP (je možné vyšetrenie stripu),
  4. myasthenia gravis s tvorbou autoprotilátok voči receptoru pre acetylcholín (AchR) a pridruženej tyrozínkináze (MuSK) – tento typ autoprotilátok zatiaľ nevyšetrujeme,
  5. autoimunitné hepatitídy (AIH) s tvorbou protilátok proti hladkému svalu (aktín pri AIH1, protilátka ASMA), respektíve protilátok proti mikrozómovému antigénu pečene a obličkových tubulov (ALKM, antibodies to liver/kidney microsome) pri AIH2; v širšom slova zmysle sem patrí aj autoimunitné poškodenie žlčovodov (sklerotizujúca cholangitída s protilátkami proti intrahepatálnym žlčovodom) a primárna biliárna cirhóza s protilátkami voči viacerým antigénom mitochondrií (napr. proti M2 ako tzv. AMA-M2 a iným; sú k dispozícii stripy pre pečeň),
  6. autoimunitné poškodenie endokrinného pankreasu – β-bunky Langerhansových ostrovčekov s tvorbou autoprotilátok voči pridruženým antigénom ako inzulín, k podjednotke tyrozínovej fosfatázy asociujúcej s inzulínom (AIA2) a protilátky AGAD (proti dekarboxyláze glutámovej kyseliny),
  7. autoimunitné poškodenie glomerulov obličiek s pasívnym ukladaním imunokomplexov alebo v dôsledku prítomnosti protilátok k mezangiu (vyšetrenie AmzgA) pri primárnej membránovej glomerulonefritíde, respektíve ukladanie protilátok ku komponentu 3 alfa-reťazca kolagénu IV bazálnej membrány kľučiek glomerulov (vyšetrenie ABMG) pri zriedkavom Goodpastureovom syndróme,
  8. autoimunitné poškodenie srdcového svalu s protilátkami proti myozínu (protilátky AMCA), respektíve proti membráne obaľujúcej myocyty (protilátky k sarkoleme),
  9. protilátky proti gliadínu (AGA), ako aj retikulínu (ARA) a proti endomýziu (AEma, terčový antigén je transglutamináza 2. typu) – sú charakteristické pre celiakiu,
  10. viaceré autoprotilátky, ktoré charakterizujú ulceróznu kolitídu (UC) a Crohnovou chorobu, dobre definujú rozdiely medzi týmito chorobami, a preto sa používajú ako ich sérologické markery; základné znaky sú protilátky k pohárikovým bunkám pozitívne (AGC) pri UC (typický nález ANA plus a súčasne ASCA mínus) a naopak pozitívne protilátky ku glykánom Saccharomyces cerevisiae (ASCA) pri negatívnych protilátkach ANA a negatívnych AGC (pri Crohnovej chorobe),
  11. protilátky proti bazálnej membráne dlaždicového epitelu (ABMA/ICS) reagujú s komplexom hemidezmozómu (o hmotnosti 180 kDa a 230 kDa) pri bulóznom pemfigoide, kým pri pemfigus vulgaris sú prítomné protilátky, ktoré reagujú s intercelulárnou substanciou dlaždicového epitelu (Dsg3 a Dsg1),
  12. protilátky k neurónom pri paraneoplastickom syndróme znázornia na rezoch mozočka buď jadrá Purkyněho buniek (anti-Hu), alebo ich cytoplazmu (anti-Yo),
  13. fluorescencia cytoplazmy krvných neutrofilných granulocytov (cANCA) sa vyskytuje najmä pri Wegenerovej granulomatóze, kým fluorescencia perinukleárnej cytoplazmy (pANCA) je častejšia pri zriedkavých ochoreniach drobných ciev (vaskulitída, polyarteritída, mikroskopická polyangiitída, periarteritis nodosa a Churgov-Straussov syndróm), ale aj pri iných stavoch spojených s autoimunitnými procesmi (ulcerózna kolitída),
  14. medzi protilátkami reagujúcimi s endokrinnými bunkami je potrebné uviesť protilátky k štítnej žľaze (koloid alebo epitel, protilátky ATA), nadobličke (pozitívna niektorá z troch vrstiev kôry, zatiaľ nevyšetrujeme), respektíve k tekálnym bunkám folikulov ovária (vyšetrujú sa metódou IF),
  15. protilátky k parietálnym bunkám žliazok (krýpt) žalúdočnej sliznice (vyšetrenie APCA) – sú typické pre atrofickú gastritídu,
  16. autoimunitné poškodenie buniek spermií s následnou poruchou plodnosti (najmenej 10 autoantigénov spermií), ktoré je príčinou neplodnosti napriek neporušenej priechodnosti vajcovodov.

Záver

Predložené texty v popisoch vyšetrení, ktoré nájdete na nasledujúcich stranách, predstavujú len časť problematiky, ktorá sa týka diagnostiky autoimunitných ochorení. Laboratórny dôkaz protilátok je jedným z bodov kritérií pri tejto diagnostike. V katalógu vyšetrení sme popísali iba najčastejšie sa vyskytujúce nálezy, pričom naša schéma vyšetrení predstavuje vo svete uznávanú postupnosť v diagnostike autoimunitných ochorení. Za metódu prvej voľby považuje väčšina autorov imunofluorescenčné vyšetrenie pacientovho séra na tkanivových substrátoch, ktoré predstavuje základný skríning pri diagnostike autoimunitných ochorení. Metóda IF väčšinou ukáže, či sa v pacientovej plazme vôbec nejaké protilátky proti vlastným štruktúram (tkanivám, bunkám a ich subštruktúram) nachádzajú, respektíve či sa vyskytuje čo i len náznak reakcie uvedeného typu (tieto séra treba ďalej vyšetriť metódou IB alebo inými metódami). Metóda imunofluorescencie je totiž založená na princípe, že pacientovo sérum dokáže v tkanivových rezoch (napríklad z krysy alebo primátov opíc) určiť, proti ktorej štruktúre je namierená príslušná autoprotilátka. V druhom identifikačnom kroku na imunoblotoch zistíme, proti akej molekule (antigénu) sú príslušné protilátky namierené. Okrem presne definovateľných štruktúr nájdeme pri IF aj také reakcie, ktoré nevieme presne identifikovať. Pri týchto vyšetreniach mnohokrát upozorníme na niečo nové, čo je potrebné podrobnejšie preskúmať. Preto v našich výsledkoch podrobne opisujeme všetky nálezy, ako aj použité substráty. Časť našich výsledkov za roky 2010 – 2011 sme opísali a štatisticky podrobne analyzovali v knižnej publikácii Diagnostika autoprotilátok proti antigénom bunkového jadra, ktorú sme vydali v roku 2013. V tejto publikácii je citovaná pomerne rozsiahla svetová – ale aj naša – literatúra týkajúca sa danej problematiky. Laboratórium Patológia Alpha medical v Martine je certifikované na testovanie autoprotilátok metódou IF a je zapojené do sústavnej kontroly kvality v medzinárodnom kontexte (Prevecal, BioSystems).

Hodnotenie článku

inVitro 1/2014

Imunológia a alergológia

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 1/2014 Imunológia a alergológia. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro