Toto je mama

Človek si už v dávnej minulosti uvedomoval svoju jedinečnosť a identitu. Jedinci v populácii sa odlišujú už svojím výzorom, morfologickými znakmi. Sú rôznorodí výškou, mohutnosťou, dĺžkou a tvarom končatín, farbou pokožky, ale najviac jedinečných znakov sa dá nájsť pri analýze tvárovej časti hlavy. Meranie morfologických parametrov, ich zakresľovanie a neskôr fotografia slúžili dlhý čas ako jediný identifikátor osôb napríklad po vojnách, nehodách alebo pri kriminalistických pátraniach. Podobnosť jedincov žiaľ pomerne často viedla k chybám s nezvratnými následkami. Sú zdokumentované početné chybné rozsudky na základe podobnosti nevinnej osoby s páchateľom...

Vývoj identifikácie osôb a preukazovania príbuznosti

Veľkým pokrokom bolo objavenie jedinečnosti papilárnych línií, ktoré sa na dlhé roky stali rozhodujúcim faktorom pre nespochybniteľnú identifikáciu. Ešte zložitejšia situácia bola pri určovaní príbuznosti. Papilárne línie pokrvných príbuzných nevykazujú jednoznačne podobné znaky a v tomto smere zlyhávajú. „Znalecké“ posudky o určení príbuznosti sa ešte pred niekoľkými desiatkami rokov robili na základe aplikácie vedomostí o dedičnosti krvných skupín, merania a popisu tvaru ušníc, nosa, farby očí, vzdialenosti očníc a pod. To, že pri určovaní príbuznosti – hlavne otcovstva – došlo v tomto období k veľkému množstvu chýb, je pochopiteľné.

Rozvoj civilného práva, uvoľnenie pravidiel náboženstva a morálky, ale aj snaha o jednoznačnú identifikáciu osôb po nešťastiach a vojenských konfliktoch viedli k snahe o ďalšie zdokonaľovanie postupov identifikácie osôb a preukazovania ich biologickej príbuznosti. Stále sa však hľadal marker, ktorý je pre danú osobu absolútne jedinečný a nepodlieha zničeniu ani po rozsiahlych zásahoch (ochorenie, mechanické poškodenie tela). Objavenie HLA systému posunulo poznatky v identifikácii osôb výrazne vpred. 

Objavenie krátkych repetitívnych sekvencií

Stanovenie krvných skupín a podskupín, imunologické a sérologické určenie aliel HLA systému poskytovali už v 70. rokoch minulého storočia také množstvo informácií, že sa začalo hovoriť o nových odboroch – forenznej biológii a genetike. Prakticky dokonalý nástroj na identifikáciu osôb a stanovenie ich biologickej príbuznosti však poskytla až možnosť analýzy DNA. Do centra pozornosti výskumných pracovníkov sa od začiatku dostávali predovšetkým neinformatívne časti DNA. Prelom nastal v roku 1984, keď boli profesorom genetiky na Univerzite v Leicesteri, sirom Alecom Jeffreysom, objavené krátke repetitívne sekvencie s vysokou variabilitou (short tandem repeats, STR). Jeffreys sa zaoberal štúdiom variability génových rodín a STR polymorfizmy nazval informatívnymi genetickými markermi. STR sú krátke opakujúce sa sekvencie, ktoré sa neprepisujú do štruktúry bielkovín. Ich funkcia v genóme nie je známa. Možno ju stratili v priebehu evolučného vývinu a dnes tvoria len „mlčiacu“ časť DNA. V ľudskom genóme bolo popísaných viac než 8 000 STR polymorfizmov. Tento počet zaručuje prakticky nekonečnú variabilitu ich kombinácií. Polymorfizmy sa dedia podľa klasických Mendelových zákonov. Už vytipovanie niekoľkých desiatok STR nám umožňuje vytvoriť jedinečný „genetický profil“ pre každú osobu. Predpokladáme, že na svete neexistujú dve osoby, ktoré by mali identický profil poskladaný z variantov krátkych sekvencií.

Objavenie polymerázovej reťazovej reakcie

O dva roky po objavení STR dostala molekulová genetika do rúk ďalší výnimočný nástroj. Mullis objavil po-lymerázovú reťazovú reakciu – PCR, ktorá umožňuje zmnožiť ľubovoľný úsek DNA a zviditeľniť ho pre ďalšie skúmanie. Prvotné analýzy PCR produktov sa robili na klasickej elektroforéze. Vzhľadom na to, že vytvárali obrazce s obrovským počtom kombinácií, podobne ako otlačky prstov, dostali názov „fingerprinting“, ktorý sa používa dodnes (Obrázok č. 1). 

Obrázok č. 1: DNA fingerprinting
Obrázok č. 1: DNA fingerprinting

Prvým reálnym prípadom, kde bola použitá metóda DNA fingerprintingu, bolo dokazovanie znásilnenia a vraždy dvoch dievčat v Leicestershire. Biologické stopy boli analyzované práve Alecom Jeffreysom pomocou metódy DNA fingerprinting a boli úspešne porovnané s biologickými vzorkami zadržaného muža, čo viedlo k jeho odsúdeniu. V bývalom Československu bola DNA analýza prvýkrát použitá v roku 1990 v prípade vraždy mladej študentky Masarykovej univerzity v Brne, kde boli zaistené kvapky krvi pravdepodobného vraha. Prelomový znalecký posudok, ktorý stotožnil krv z miesta činu s podozrivým mužom, vypracoval doc. RNDr. Vladimír Ferák, vedúci katedry genetiky a molekulárnej chémie PriF UK v Bratislave, s ktorým je v tomto čísle publikovaný zaujímavý rozhovor o genetickej genealógii a pátraní po predkoch na str. 32. Posudok tohto výnimočného vedca umožnil aj zadržanie najhoršieho sériového vraha v histórii Slovenska Ondreja Riga.

Ako funguje stanovenie paternity?

Ako sme už uviedli, variabilita ľudského genómu je nesmierna. Doposiaľ neboli nájdení dvaja jedinci, ktorí by sa zhodovali v celej sekvencii DNA. Aj u dvojčiat môžeme predpokladať, že v dôsledku mutácií vzniknutých v priebehu života môžu medzi nimi existovať malé rozdiely. Zatiaľ čo lekárska genetika skúma predovšetkým variabilitu tzv. kódujúcej DNA, forenzná genetika sa sústredí výhradne na nekódujúce oblasti – už spomínané STR polymorfizmy.

Každá repetitívna sekvencia je v genóme prítomná v páre. Jedna časť páru je od matky a druhá od otca. Ak počet opakovaní u oboch kópií získaných od rodičov a nachádzajúcich sa na tom istom mieste chromozómu nie je rovnaký, vieme spätne vypátrať, od ktorého z rodičov (prarodičov, príbuzných) sekvencia pochádza. Takéto polymorfizmy využívame pri paternitných sporoch a identifikáciách.

Uveďme si niekoľko základných príkladov. Muž má tandemovú repetíciu o opakovaniach 16/16 (od otca aj od matky zdedil sekvenciu, ktorá má 16 opakovaní určitej kombinácie báz). Žena má usporiadanie danej repetície napríklad 15/15 (otec aj matka na ňu preniesli zhodne po 15 opakovaní danej kombinácie báz). Potomok musí zdediť kombináciu otca a matky, preto môže mať len kombináciu 16/15.

Trochu komplikovanejšou je situácia, keď má muž napríklad kombináciu 16/18. Jeho spermie sú potom z 50 % nositeľmi 16 opakovaní a z 50 % nositeľmi 18 opakovaní. Ak je matka nositeľom kombinácie 15/15, potomkovia budú mať s 50-percentnou pravdepodobnosťou usporiadanie opakovaní 16/15 a s 50-percentnou pravdepodobnosťou 18/15. 

Tandemové repetície, ktorých počet opakovaní je rovnaký u otca aj u matky, sa na stanovenie paternity pochopiteľne nedajú využiť. Označujeme ich ako neinformatívne. Pri paternitnej alebo identifikačnej analýze DNA prednostne využívame tie tandemové repetície, o ktorých zo skúsenosti vieme, že v populácii, z ktorej testovaní rodičia pochádzajú, sú najviac polymorfné (rôznorodé, rozličnej dĺžky). O takýchto sekvenciách hovoríme, že sú informatívne.

Čím viac informatívnych sekvencií zaradíme do testu, tým je výsledok presnejší. Komerčné kity, ktoré umožňujú analýzu tandemových repetícií (STR) dnes pracujú s veľkou presnosťou. Štandardom je multiplex PCR, ktorým sa amplifikuje 16 STRs rozdielnych fluorescenčne značených lokusov. Prakticky jediným možným spôsobom zlyhania a chybnej interpretácie výsledku z analýzy STR je mutácia u potomka, ktorá by zmenila repetitívnu sekvenciu tak, že by sa zhodovala so sekvenciou testovaného muža, aj keby v skutočnosti nebol otcom. Pravdepodobnosť takejto zámeny je ale mizivá. STR systémy sú navrhnuté tak, že mutácie majú frekvenciu asi 1: 1 000. Možnosť, že by naraz zmutovalo všetkých 16 použitých sekvencií tak, aby imitovalo genóm testovaného muža, aj keď nie je otcom, sa preto rovná prakticky nule. 

Pravdepodobnosť zhody dvoch jedincov v populácii je 10-17. Ak otcovstvo označeného muža nie je vylúčené, môžeme vypočítať jeho percentuálnu pravdepodobnosť. Pri vyšetrení 16 STR lokusov je stanovená pravdepodobnosť otcovstva vyššia než 99.9999%. Genetickou analýzou teda dokážeme prisúdiť biologický materiál konkrétnej osobe s pravdepodobnosťou, ktorá hraničí s istotou. 

Ukážkovým príkladom využitia mitochondriálnej DNA je analýza kostrového nálezu v hromadnom hrobe v Jekaterinburgu, kde boli identifikované ostatky ruského cára Nikolaja II., cárovnej a jej dvoch dcér.
Ukážkovým príkladom využitia mitochondriálnej DNA je analýza kostrového nálezu v hromadnom hrobe v Jekaterinburgu, kde boli identifikované ostatky ruského cára Nikolaja II., cárovnej a jej dvoch dcér.
Pravdepodobnosť otcovstva vyššia než 99,75 % sa podľa medzinárodných konvencií označuje výrazom „otcovstvo prakticky dokázané“.

Repetitívne sekvencie lokalizované na chromozóme Y sa dedia v nezmenenej podobe výhradne z otca na syna ako jeden celok – tzv. haplotyp Y-STR. U mužov v otcovskej línii je totožný. Potvrdenie príbuznosti v línii otec – syn je preto pomerne ľahké, nepotrebujeme ani vzorku matkinej DNA.

Ženská obdoba Y chromozómu je mitochondriálna DNA. Táto kruhová molekula sa nachádza v mitochondriách a z hľadiska identifikácie osôb je takisto zaujímavá. Mitochondriálna DNA sa dedí po materálnej línii z matky na jej potomkov (dcéry aj synov). Mitochondriálna DNA môže priniesť cenné informácie o vzdialenejšom stupni príbuzenstva. Ukážkovým príkladom jej využitia je analýza kostrového nálezu v hromadnom hrobe v Jekaterinburgu, kde boli identifikované ostatky ruského cára Nikolaja II., cárovnej a jej dvoch dcér – porovnaním sekvencie mitochondriálnej DNA so živými príbuznými. Jedným z nich bol manžel súčasnej britskej kráľovnej Alžbety II, princ Filip. 

Obrázok č. 2: Princíp určenia otcovstva pomocou troch informatívnych STR separovaných elektroforeticky. Prvé dve sekvencie – nachádzajúce sa na lokusoch 1 a 2 – sú informatívne, takže vieme určiť, či ich dieťa zdedilo od matky alebo od otca.

Vhodný biologický materiál na paternitné analýzy získavame spravidla neinvazívne – sterom z bukálnej sliznice. V menšej miere sa využívajú vzorky krvi, vlasy a nechty. Vzorky sa rutinne odoberajú matke, dieťaťu a označenému mužovi, respektíve iba dieťaťu a označenému mužovi. Ak je pravdepodobný otec mŕtvy alebo nezvestný, a príbuznosť sa potvrdzuje napríklad pre preukázanie nároku na dedičstvo, odber biologického materiálu sa realizuje starým rodičom z otcovej strany. Paternitnú analýzu je možné realizovať aj pred narodením dieťaťa, z plodovej vody alebo z choriových klkov.

Pater semper incertus est

Otec je – na rozdiel od istej matky – vždy neistý. Štatistiky hovoria, že približne štyri percentá mužov vychovávajú cudzie dieťa v presvedčení, že je ich vlastné. Naopak, asi päťsto mužov na Slovensku ročne požiada o zapretie otcovstva. Správne určenie otcovstva odstráni pochybnosti medzi rodičmi a zároveň je dôležité pri určovaní práv maloletého dieťaťa.

Obrázok č. 3: Fragmentačná analýza, vyhodnocovanie DNA profilov prostredníctvom STRs, patrí k štandardným metódam paternitnej analýzy. Na obrázku je ukážka zhody DNA profilov matky, dieťaťa a označeného muža, kde je otcovstvo prakticky dokázané.

Ak sa dostane prípad zapretia otcovstva až pred súd, ten na vypracovanie posudku vyžaduje súdneho znalca z oblasti forenznej genetiky. Pri takomto posudku sa – okrem iného – kladie dôraz na presnú identifikáciu vzoriek. Stery alebo krvné odbery spravidla vykonáva sám súdny znalec alebo iná osoba (sestrička) v jeho prítomnosti. Ak to nie je možné, musia sa vzorky odobrať tak, aby nevznikla pochybnosť o ich jednoznačnej identifikácii. Ak odber realizuje lekár, musí zabezpečiť presnú identifikáciu odobraných vzoriek on. Okrem údajov z preukazov totožnosti sa k vzorke spravidla prikladá aj otlačok palca, aby sa jednoznačne preukázala prítomnosť testovanej osoby. 

Ak sa chce potenciálny otec takejto procedúre vyhnúť, môže vzorky sebe a dieťaťu (synovi) odobrať sám (pri dcére treba získať aj vzorku DNA od matky) a následne sa obrátiť priamo na laboratórium. 

Tieto testy síce pred súdom neobstoja, ale mužovi môžu poskytnúť informáciu o tom, či má pre neho zmysel ísť do súdneho procesu o zapretie (alebo naopak potvrdenie) otcovstva. Ak výsledok jednoznačne vylúči alebo potvrdí otcovstvo a matka tento výsledok neakceptuje, muž sa musí obrátiť na súd a testy podstúpiť ešte raz u súdneho znalca.

Obrázok č. 3: Fragmentačná analýza, vyhodnocovanie DNA profilov prostredníctvom STRs, patrí k štandardným metódam paternitnej analýzy. Na obrázku je ukážka zhody DNA profilov matky, dieťaťa a označeného muža, kde je otcovstvo prakticky dokázané.

Záver

Pri vykonávaní testov DNA sme zaznamenali aj pozoruhodné príhody. Lekárka žiadala o jednoznačnú identifikáciu otca. Postupne priniesla 6 (slovom šesť) vzoriek na analýzu. No, proti gustu žiaden dišputát, ako hovoril môj otec.

Medzi kuriozity určite spadá aj požiadavka na potvrdenie príbuznosti medzi matkou a dieťaťom, ktorú nám zaslal zdravotnícky personál pôrodníckeho oddelenia. Môžeme sa iba domnievať prečo...

V tomto smere nie je absolútne nezmyselná požiadavka matky, ktorá žiadala o potvrdenie príbuznosti so svojou dcérou, keďže sa jej zdalo, že sa na ňu dieťa nepodobá…

Literatúra

  1. Schneiderka P. Homocysteinemie a folatemie v éře fortifikace folátem,Klin. Biochem. Metab., 16 (37), 2008, No. 4, p. 228 – 231.
  2. Hyánek J. Prakticky málo známé nežádoucí důsledky nedostatku vitaminu B-12, InVitro Diagnostika 12/2009, p. 5 – 9
  3. MUDr. Katarína Klobučníková, doc. MUDr. Jaroslav Pancák, PhD., prof. MUDr. Pavel Traubner, PhD., Neuroanemický syndróm v neurologickej praxi, Neurol. pro praxi, 2008; 9(3): 176 – 178
  4. Vávrová J. a spol. Vitamíny a stopové prvky. ČSKBČLS JEP a SEKK, 2007.
  5. Joosten E., v.d. Berg A., Reizler R.: Metabolic evidence the deficiencies of vitamin B12, folate and vitamin B6 occur commonly in the elderly. Amer. J. Clin. Nutr., 1993,58, 468 – 76.
  6. Marcuard S. P., Albernarz L., Khauanmie, P. G. Omeprazole therapy causes malapsorption of cyanlocobalamin. ANN. Internm.Med., 1994, 120, 211 – 15.
  7. Miller J. W., Green R., Herbert V. D. et al. Holotranscobalamin II is a reliable indicator of improved vitamin B12 status in healthy elderly people with suboptimal B12 status following oral B12 supplements. Blood, 1999, 94, Suppl. 1/2, 17 – 18.
  8. Rosenblatt D. S., Fenton W. A.: Inherited disorders of folate and cobalamin transport and metabolism. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Metabolic Disorders (Scriver Ch. Edit) 2001, McGrawHill, Co New York
  9. Stabler S. P: Vitamin B12 deficiency in older people: improving diagnosis and preventing disability. J. Am. Geriat. Soc., 1998, 46, 1317 – 19
Hodnotenie článku

doc. MUDr. RNDr. Juraj Šimko, PhD.

Spoluautor

manažér Diagnostického centra lekárskej genetiky Alpha medical a odborný zástupca

Zobraziť všetky články

inVitro 3/2015

Genetika

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 3/2015 Genetika. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro