Úloha aberantnej metylácie DNA v nádorových ochoreniach

Nádorové choroby predstavujú u ľudí heterogénnu skupinu ochorení, ktoré sú zapríčinené akumuláciou početných genetických, ako aj epigenetických zmien. Poznanie nových molekulových vlastností nádorového tkaniva prispieva k zavádzaniu inovatívnych diagnostických postupov a efektívnejších terapeutických stratégií. 

Úvod

Nádorové ochorenia tvoria veľkú skupinu chorôb s rôznou lokalizáciou nádorov a variabilnými klinickými prejavmi. Nádorové tkanivo predstavuje heterogénne zoskupenie buniek a v porovnaní s normálnym tkanivom vykazuje početné molekulové zmeny, ktoré umožňujú predovšetkým nekontrolované bunkové delenie, ako aj ďalšie prejavy nádorového procesu. Za dobre preštudované sa dnes považujú genetické anomálie, ktoré zahrňujú zmeny v sekvencii DNA, ako sú mutácie a polymorfizmy, straty celých chromozómov alebo ich častí a tiež rôzne chromozómové prestavby. Genetické zmeny zapríči ňujú expresiu zmenených alebo skrátených génov, alebo sa expresia nerealizuje vôbec, čo v konečnom dôsledku vedie k produkcii nefunkčných proteínov alebo k ich chýbaniu. Epigenetické procesy zohrávajú v normálnych bunkách kľúčovú úlohu pri aktivácii a inaktivácii špecifických génov potrebných v konkrétnom stave bunky, či v jednotlivých štádiách vývoja organizmu, alebo pri bunkovej diferenciácii v tkanivách. Epigenetické zmeny sú v nádorovom tkanive príčinou abnormálnej transkripcie génov, čo znamená, že bunka obsahuje v aktuálnom stave zmenené hladiny génových produktov a výsledkom je významné narušenie regulovaného bunkového metabolizmu. Na základe súčasných poznatkov sú genetické aj epigenetické zmeny považované za závažnú príčinu malígnej transformácie, t. j. premeny normálnej bunky na nádorovú.

Metylácia DNA v nádoroch

Epigenetické procesy sú definované ako dedičné zmeny v expresii génov bez zmeny v samotnej sekvencii DNA. Zahrňujú niekoľko základných mechanizmov, konkrétne metyláciu DNA, modifikácie histónov a s nimi súvisiace zmeny v štruktúre chromatínu (1, 2). Epigenetické mechanizmy sú schematicky znázornené na Obrázku č. 1.

Obrázok č. 1: Epigenetické mechanizmy v molekule DNA (upravené podľa Zaidi et al., 2010) (3)

V normálnych bunkách je metylácia DNA prísne regulovaný proces. Je uskutočňovaná naviazaním -CH3 skupiny na 5` pozíciu cytozínu v CpG dinukleotidoch, ktoré sú vo veľkom počte zoskupené v tzv. CpG ostrovčekoch. V ľudskom genóme sú CpG ostrovčeky roztrúsené nerovnomerne, ale až u 60 % kódujúcich génov sú lokalizované v promótoroch, t. j. v regulačných oblastiach jednotlivých génov, čo poukazuje na významnú úlohu epigenetických mechanizmov v regulácii génovej transkripcie. Aktívne prepisované gény majú promótorové sekvencie a prvý exón spravidla nemetylované, aby bol umožnený prístup transkripčným faktorom a ostatným komponentom transkripčného komplexu. Naopak, metylácia DNA blokuje prepis neaktívnych génov, tiež repetitívnych a endoparazitických sekvencií (4).

V nádoroch je regulácia metylácie DNA narušená. V nádorovom tkanive boli pozorované dva protichodné aberantné procesy, a to hypermetylácia promótorov špecifických génov a globálna hypometylácia genómu. Do skupiny génov vyradených hypermetyláciou patria predovšetkým tie, ktoré bránia vzniku nádoru, t. j. tumor supresorové gény, ďalej gény zodpovedné za opravu DNA, gény pre reguláciu rastu a delenia buniek a tiež mnohé sekvencie, ktoré nie sú asociované s doteraz známymi génmi. Porovnanie štruktúry aktívneho génu (napríklad tumor supresorového génu) v normálnej bunke a génu vyradeného DNA metyláciou v nádorovej bunke je schematicky znázornené na Obrázku č. 2. 

V nádorovom tkanive sa prostredníctvom zníženej metylácie (hypometylácie) uvoľňuje transkripcia génov a sekvencií DNA, ktoré sa normálne neprepisujú. Ide predovšetkým o onkogény, opakované sekvencie a cudzorodé molekuly DNA.

Nedávno bol objavený nový spôsob epigenetickej regulácie génovej expresie, ktorý sa uskutočňuje prostredníctvom krátkych nekódujúcich RNA molekúl nazvaných mikroRNA (miRNA). Tieto molekuly s dĺžkou približne 22 nukleotidov sú vysoko konzervované a prispievajú k regulácii kľúčových biologických procesov, ako sú diferenciácia, vývoj alebo bunková proliferácia (6). Mnohé typy nádorov vykazujú aberantné expresné profily miRNA molekúl. MiRNA môžu pôsobiť ako onkogény, tumor supresorové gény alebo ako modulátory metastatického rozsevu a regulátory nádorových kmeňových buniek. Epigenetická deregulácia génov kódujúcich tieto miRNA molekuly vrátane aberantnej metylácie môže tiež prispieť ku vzniku nádorov (7).

Obrázok č. 2: Metylácia DNA a organizácia chromatínu v normálnej a nádorovej bunke (prevzaté od Fridrichová, 2010) (5)
Výsledky mnohých štúdií ukazujú, že hodnotenie metylácie DNA v promótoroch špecifických génov predstavuje významný potenciál na zlepšenie včasnej diagnostiky nádorov, predikciu prognózy a odpovede na liečbu. Gény metylované v skorých štádiách tumorigenézy predstavujú potenciálne markery na identifikáciu jedincov so zvýšeným rizikom a pre spresnenie diagnostiky skorých štádií. Gény, ktoré nadobúdajú metylácie v priebehu nádorového ochorenia, sú potenciálne prognostické markery. Navyše, hodnotenie metylácie génov zodpovedných za senzitivitu alebo rezistenciu k liečivu môže poskytnúť informáciu pre účinnú liečbu. Výsledky výskumov ukazujú, že jednotlivé typy a štádiá nádorov by mohli mať špecifické spektrum metylovaných génov (8). Bola tiež pozorovaná heterogenita v rámci jedného nádoru, t. j. nádorové tkanivo obsahovalo viaceré populácie buniek s rôznym stupňom a spektrom molekulových anomálií vrátane aberantných metylačných profilov. Vzhľadom na uvedené skutočnosti nadobúda čoraz väčší význam skúmanie molekulových vlastností nádorov v „tekutých biopsiách“, ktoré zahŕňajú cirkulujúce nádorové bunky a voľné fragmenty nádorovej DNA v krvi pacientov. Inými slovami, vo vzorke periférnej krvi je možné analyzovať rôzne nádorové lézie, od primárnych nádorov až po metastázy, čo umožňuje monitoring evolúcie nádoru alebo sledovanie efektivity podávanej terapie (9).

Epigenetické laboratórium na Oddelení genetiky ÚEO BMC SAV je jedným z dvoch pracovísk na Slovensku, ktoré sa zaoberajú štúdiom patogénnych zmien v metylácii DNA v súvislosti s nádorovým procesom. V minulosti sme na hodnotenie metylácie DNA zaviedli dve kvalitatívne metódy, avšak výsledky analýz na bunkových líniách a tiež u pacientov s nádormi hrubého čreva a prsníka ukázali, že na presnejšie stanovenie metylačného profilu treba používať sofistikované kvantitatívne metódy, ktoré sú zároveň primerane prístupné pre klinické pracoviská. Môj výskumný tím sa už niekoľko rokov zaoberá problematikou aberantných metylačných zmien v karcinóme prsníka s cieľom identifikovať epigenetické biomarkery pre pokročilejšie formy tohto ochorenia. V počiatočnej fáze štúdií sme zaviedli kvantitatívnu metódu založenú na real-time technológii, a to kvantitatívnu multiplexnú metylačne špecifickú PCR. Touto metódou sme vyšetrili 92 pacientok s karcinómom prsníka a zistili sme, že stúpajúci trend metylácie v RASSF1A géne bol asociovaný s veľkosťou nádoru, statusom lymfatických uzlín a vyšším TNM štádiom, preto by táto metylácia mohla byť použitá ako univerzálny nádorový marker. Zriedkavá, ale vysoká metylácia CDH1 génu korelovala so statusom lymfatických uzlín, preto by mohla odhaliť metastatický potenciál nádorov prsníka (10). V ďalšom súbore 151 pacientok sme zistili pozitívnu koreláciu hladiny metylácie RASSF1A génu v nádorovom tkanive a percentom nádorových buniek prsníka s pozitívnou expresiou estrogénového a progesterónového receptora. Tento poznatok môže byť užitočný pri prognózovaní odpovede na hormonálnu terapiu (11). V roku 2010 sme na analýzu metylačných profilov zaviedli unikátnu kvantitatívnu metódu, ktorá začala byť využívaná vo svetových laboratóriách len nedávno, a to pyrosekvenovanie. V nasledujúcom projekte sme sa sústredili na štúdium vzťahu hladiny metylácie DNA v 11 génoch zodpovedných za reguláciu rastu buniek, invazivity a metastázovania so stupňom agresivity nádorov prsníka a overenie asociácie identifikovaných metylačných profilov s inhibíciou expresie relevantných proteínov. Metylačné profily sme analyzovali u 206 pacientok vo viacerých typoch biologických vzoriek, a to v primárnych nádoroch, metastatických lymfatických uzlinách, plazme a v lymfocytoch. Expresiu proteínov sme stanovili imunohistochemicky v nádoroch aj v uzlinách. Výsledky kumulatívnej metylácie všetkých 11 analyzovaných génov u 57 pacientok s metastatickými lymfatickými uzlinami sú prezentované na Obrázku č. 3. V invazívnych nádoroch prsníka sme najčastejšie zaznamenali nádorovo špecifickú hypermetyláciu v RASSF1A, APC, CXCL12ADAM23 génoch, pričom sme identifikovali pozitívne korelácie medzi hladinami metylácie v nádoroch a v metastatických lymfatických uzlinách, čo indikuje uchovanie aberantnej metylácie v priebehu tumorigenézy prsníka. Avšak ani v nádoroch, ani v metastatických uzlinách sme nenašli vzťah stúpajúcej hladiny metylácie DNA s klesajúcou expresiou proteínov, čo naznačuje, že metylácia DNA v týchto génoch nie je jediným mechanizmom inhibície génovej expresie s následnou stratou proteínových produktov. Štatisticky významne zvýšená hladina metylácie v génoch RASSF1A, APC, CXCL12ADAM23 u pacientok s pozitívnou expresiou estrogénového receptora indikuje – v porovnaní negatívnymi – adekvátnejšie využitie hodnotenia metylácie DNA pri estrogén-receptor-pozitívnych prípadoch. Hypermetylácia promótoru CXCL12 génu zvyšovala riziko vzniku metastáz v lymfatických uzlinách, hypermetylácia ADAM23 promótoru zvyšovala riziko vyššej proliferačnej aktivity nádorových buniek meranej expresiou Ki67 proliferačného faktoru. Kvantifikácia metylácie CXCL12ADAM23 génov preto môže slúžiť na monitoring metastatického potenciálu nádorov prsníka (12).

Obrázok č. 3: Kumulatívna metylácia DNA všetkých 11 analyzovaných génov (v %) u pacientok s metastatickými lymfatickými uzlinami (prevzaté od Fridrichová et al., 2015) (12)

Záver

Podľa súčasných poznatkov je nepochybné, že epigenetické mechanizmy zohrávajú v procese tumorigenézy významnú úlohu. Problematika biomarkerov v onkológii založených na zmenenej metylácii DNA je vo svetových laboratóriách pomerne široko rozpracovaná a nasmerovaná predovšetkým na markery pre rôzne štádiá tumorigenézy alebo na predikciu odpovede na liečbu. Výhodou epigenetických biomarkerov je, že aberantné zmeny v epigenetických procesoch je možné identifikovať skôr, než môžu byť odhalené patologické štrukturálne zmeny v tkanivách bežnými makro- a mikroskopickými prístupmi. V našich štúdiách budeme naďalej skúmať asociáciu identifikovaných metylačných profilov s klinicko-patologickými parametrami pokročilejších nádorov prsníka, aby sme vyhodnotili možnosti klinického využitia špecifických vzorov metylácie DNA na testovanie metastatického potenciálu. Avšak pre rutinné klinické využitie musia byť naše výsledky verifikované na veľkých súboroch pacientok.


Literatúra

  1. Jones P. A., Baylin S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature Rev Genet 2002; 3:415 – 28
  2. Fraga M. F., Esteller M. Towards the human cancer epigenome: a first draft of histone modification. Cell Cycle. 2005;4:144 – 148
  3. Zaidi S. K., Young D. W., Montecino M., Lian J. B., Stein J. L., van Wijnen A. J., Stein G. S. Architectural epigenetics: mitotic retention of mammalian transcriptional regulatory information. Mol Cell Biol. 2010 Oct;30(20):4758 – 66
  4. Rollins R. A., Haghighi F. , Edwards J .R., Das R., Zhang M. Q., Ju J., Bestor T. H. Large scale structure of genomic methylation patterns. Genome Res, 2006;16:157 – 163
  5. Fridrichová I. The Role of DNA Methylation in Colorectal Cancer, In: Epigenetics Mechanisms, Functions and Human Effects, Editors: Balázs Pintér and Zsolt Mészáros, Chapter V, pp. 133-158, 2010, Nova Science Publishers, Inc. New York, USA,. ISBN: 978-1-60741-454-4
  6. Nguyen D. X., Bos P. D., Massagué J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 2009, 9:274 – 84
  7. Lopez-Serra P., Esteller M. DNA methylation-associated silencing of tumor-suppressor microRNAs in cancer. Oncogene. 2012; 13:1609 – 22
  8. Duffy M. J., Napieralski R., Martens J. W. et al. Methylated genes as new cancer biomarkers. Eur J Cancer. 2009, 45:335 – 346
  9. Crowley E., Di Nicolantonio F., Loupakis F., Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol. 2013; 10:472-84
  10. Sebova K., Zmetakova I., Bella V., Kajo K., Stankovicova I., Kajabova V., Krivulcik T., Lasabova Z., Tomka M., Galbavy S., Fridrichova I. RASSF1A and CDH1 hypermethylation as potential epimarkers in breast cancer. Cancer Biomark. 2011-2012;10:13-26.
  11. Kajabova V., Smolkova B., Zmetakova I., Sebova K., Krivulcik T., Bella V., Kajo K., Machalekova K., Fridrichova I. RASSF1A Promoter Methylation Levels Positively Correlate with Estrogen Receptor Expression in Breast Cancer Patients.Transl Oncol. 2013, 6:297 – 304
  12. Fridrichova I., Smolkova B., Kajabova V., Zmetakova I., Krivulcik T., Mego M., Cierna Z., Karaba M., Benca J., Pindak D., Bohac M., Repiska V., Danihel L. CXCL12 and ADAM23 hypermethylation are associated with advanced breast cancers.Transl Res. 2015,165:717 – 30
Hodnotenie článku

inVitro 1/2016

Onkológia

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 1/2016 Onkológia. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro