Sliny ako doplnkové vyšetrovacie médium sú endokrinológom známe už vyše 40 rokov. Vyšetrenie slín umožňuje vyhnúť sa odberu krvi zo žily a s ním spojeným stresom, bolesťou v mieste venepunkcie, návšteve pacienta na klinickom pracovisku alebo vice versa klinického personálu v domácom prostredí pacienta.

Zber slín je pacientmi ľahko akceptovateľný, neinvazívny a vyžaduje minimálny tréning. Umožňuje tak zber viacpočetných vzoriek na vyšetrenie akýchkoľvek intra-individuálnych biologických variácií. Napriek sľubnému analytickému prínosu a výhod v podobe ceny a spolupráce pacientov, slinové eseje neprešli do klinickej praxe. Jedinou výnimkou je kortizol v diagnostike Cushingovho syndrómu.

Odber a analýza

Základné spôsoby zberu slín sú dva – pasívne slinenie („passive drool“) a zber s absorbentom (býva ním bavlnený alebo syntetický tampón). Metodiky sú porovnané v Tabuľke č. 2. V klinickej praxi a vo väčšine štúdií sa sliny zbierajú pomocou absorbentov, z ktorých sa následne získavajú centrifugáciou. V súčasnosti sú dostupné viaceré komerčné zberné skúmavky od viacerých výrobcov. Všetky systémy využívajú tampóny, ktoré sa na presne definovaný čas (väčšinou 1 – 2 minúty) vkladajú buď pod jazyk, alebo na vnútornú stranu líca, kde nasiaknu slinami a následne sa vložia do zberného kontajneru.

Vďaka svojej stabilite v slinách sú steroidy priam predurčené na stanovovanie v slinách. Aj pri skladovaní pri izbovej teplote sú glukokortikoidy a androgény v „neošetrených“ slinách stabilné niekoľko dní, čo umožňuje zasielanie vzoriek do laboratória poštou. Na správne predanalytické ošetrenie vzoriek sú náročnejšie peptidy – vo väčšej miere adsorbujú k stenám skúmaviek a okrem toho sliny obsahujú proteolytické enzýmy, ktoré spôsobujú rýchlu degradáciu peptidových hormónov. Stratám spôsobeným adsorbciou a degradáciou je možné predísť použitím špeciálnych skúmaviek (tzv. low-protein-binding cryotube) a pridaním konzervačných látok (napríklad EDTA). Na vylúčenie prípadnej kontaminácie krvou sa odporúča merať transferín v slinách. Je dôležité, aby si laboratóriá vyšetrujúce vzorky slín validovali slinovú matrix. Jednoduché nahradenie slín za eseje, ktoré sú primárne určené na meranie steroidov v krvi zvyčajne vedie k nepresnostiam.

Indikácie a perspektívy na klinické využitie vyšetrovania hormónov v slinách

Indikácie na vyšetrovanie hormónov v slinách sú uvedené v Tabuľke č. 3.

Skríning hyperkortizolizmu (Cushingovho syndrómu)

Včasná diagnóza Cushingovho syndrómu (CS) je jednou z najväčších výziev klinickej endokrinológie. Na rozdiel od zdravých ľudí, u pacientov s CS nedochádza k poklesu sekrécie kortizolu vo večerných hodinách. Jedným z charakteristických znakov CS je tak narušenie cirkadiánnej rytmicity sekrécie kortizolu, a preto sa meranie kortizolu neskoro večer alebo o polnoci považuje za veľmi jednoduchý a užitočný spôsob skríningu CS (viď Obrázok č. 1). Meranie nočného sérového kortizolu má vysokú senzitivitu a špecificitu pre CS akejkoľvek etiológie. Hlavným problémom v rutinnej klinickej praxi je získanie nočnej nestresovej vzorky krvi. Riešením problému je stanovenie nočného kortizolu v slinách – ako náhrada za sérový kortizol. Na použitie neskorého nočného slinového kortizolu v detekcii CS poukázal už v roku 1985 Luthold et al. Diagnostická presnosť tejto metódy v diagnostike Cushingovho syndrómu sa potvrdila vo viacerých následných štúdiách u dospelých a detí. Použitie slín je dnes bežne zavedenou metodikou a zahŕňa ho aj posledné Klinické odporúčanie Endokrinologickej spoločnosti pre diagnostiku CS. Pokus o diagnostiku miernej formy CS bez merania nočného kortizolu v slinách je v podstate ako pokus o diagnostiku subklinickej periférnej hypertyreózy bez stanovenia TSH.

Sledovanie fyziologických a patologických hormonálnych zmien v športovej medicíne

V súčasnosti sú jedinými akceptovanými telesnými tekutinami na antidopingové testovanie – ako ich uvádza Svetová antidopingová agentúra (World Anti-Doping Agency) – moč a krv. Odbery slín môžu vyriešiť niektoré špecifiká antidopingového testovania – sú jednoduché, neinvazívne, pohlavne neutrálne a priamo kontrolovateľné. V neposlednom rade majú limitované možnosti falšovania, čo je hlavným problémom pri testovaní vzoriek moču. Je tak iba otázkou času, kedy vyšetrovanie exogénne podávaných steroidov (respektíve iných zakázaných hormonálnych látok) v slinách rozšíri možnosti antidopingového monitoringu športovcov. Pozoruhodné pritom je, že sliny sa už bežne používajú na monitorovanie požitia drog na pracoviskách, v klinickej toxikológii, trestnom práve a v programoch vedenia vozidiel pod vplyvom drog.

Monitoring steroidov u pacientov s adrenokortikálnym karcinómom a liečených mitotanom

Mitotan je liekom prvej voľby v adjuvantnej liečbe u pacientov s adrenokortikálnym karcinómom – či už po kompletnej resekcii, pri rekurencii alebo v prípadoch inoperabilného a/alebo metastatického ACC. Svojím účinkom (priamy cytotoxický efekt na adrenokortikálne bunky a blokácia steroidogenézy inhibíciou 20,22-dezmolázy a 11ß-hydroxylázy) navodzuje adrenokortikálnu insuficienciu, ktorá vyžaduje substitučnú liečbu hydrokortizónom. Pri monitoringu substitučnej liečby nie je možné používať ani sérový kortizol, pretože mitotan zvyšuje hladinu globulínu viažuceho kortizol (CBG) (hladiny sérového kortizolu sú preto zvýšené), ani voľný močový kortizol. Mitotan zároveň zvyšuje klírens steroidov, preto sú zvýšené aj hladiny voľného močového kortizolu a na dosiahnutie adevátnej substitúcie navyše pacienti vyžadujú 2 – 3-násobne vyššie dávky hydorkortizonu.

Ako nepriamy ukazovateľ možno použiť stanovenie hladín ACTH, treba však mať na pamäti, že hladiny sú pulzné a u pacientov s ACC s pretrvávajúcim hyperkortizolizmom dlhodobo suprimované. Slinový kortizol nie je ovplyvnený zmenami CBG a korelujúc s hladinami voľného kortizolu v sére presnejšie odzrkadľuje substitučnú liečbu hydrokortizónom u pacientov liečených mitotanom. Tu treba zdôrazniť, že metodikou voľby je vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC) s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS/MS). Dôvodom je fakt, že mitotanom navodená inhibícia steroidogenézy vedie k akumulácii intermediátov a štrukturálne podobných steroidov, ktoré sú príčinou skríženej reaktivity (s endogénnymi steroidmi ako napríklad 6ß-hydroxykortizol, 21-deoxykortizol, kortikosterón a s konjugovanými derivátmi kortizolu) a falošne zvýšených hladín kortizolu pri stanovení metodikou ECLIA (elektrochemiluminiscenčná imunoesej).

Stanovenie peptidových hormónov

Pre väčšinu peptidových hormónov neexistujú referenčné normy v slinách. Tento fakt sa všeobecne využíva pri kvantitatívnom stanovení peptidových hormónov, keď slúžia ako sľubné markery špecifických ústnych ochorení a pravdepodobne sa stanú užitočnými pri nádoroch hlavy a krku a nádoroch ústnej dutiny.

Záver

Klinický prínos stanovovania hormónov v slinách je nesporný a zároveň nedocenený. Hlavnou a najčastejšie uvádzanou prekážkou je absencia výskumu, štandardizácie a referenčných noriem, avšak všetky tieto problematiky sú kameňmi úrazu aj pri stanovovaní hormónov „bežnými“ metodikami v „štandardných“ telesných tekutinách. Dúfa(j)me, že stanovovanie hormónov v slinách sa stane bežnou súčasťou rutinnej klinickej endokrinologickej praxe.

Literatúra:

1. Anizan S, Huestis MA. The potential role of oral fluid in antidoping testing. Clin Chem (2013) 60: 307 – 322
2. Carrozza C, Lapolla R, Gervasoni J, Rota CA, Locantore P, Pontecorvi A, Zuppi C, Persichilli S. Assessment of salivary free cortisol levels by liquid chromatography with tandem massspectrometry (LC-MS/MS) in patients treated with mitotane. Hormones (2012) 11: 344 – 349
3. Gafni RI, Papanicolaou DA, Nieman LK. Nighttime salivary cortisol measurement as a simple, noninvasive, outpatient screening test for Cushing’s syndrome in children and adolescents. J Pediatr (2000) 137: 30 – 35
4. Gröschl M, Rauh M, Dörr HG. Circadian rhythm of salivary cortisol, 17-hydroxyprogesterone and progesterone levels in healthy children. Clin Chem (2003) 49: 1688 – 1691
5. Gröschl M. Current status of salivary hormone analysis. Clin Chem (2008) 54: 1759 – 1769
6. Harmon AG, Hibel LC, Rumyantseva O, Granger DA. Measuring salivary cortisol in studies of child development: watch out – what goes in may not come out of saliva collection devices. Dev Psychobiol (2007) 49: 495 – 500
7. Keevil BG, MacDonald P, Macdowall W, Lee DM, Wu FCW and the NATSAL Team. Salivary testosterone measurement by liquid chromatography tandem mass spectrometry in adult males and females. Ann Clin Biochem (2014) 51: 368 – 378
8. Kozaki T, Hashiguchi N, Kaji Y, Yasukouchi A, Tochihara Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol (2009) 107: 743 – 746
9. Luthold WW, Marcondes JA, Wajchenberg BL. Salivary cortisol for the evaluation of Cushing’s syndrome. Clin Chim Acta (1985) 151: 33 – 39
10. Martinelli CE, Sader SL, Oliveira EB, et al. Salivary cortisol for screening of Cushing’s syndrome in children. Clin Endocrinol (1999) 51: 67 – 71
11. Newell-Price J, Trainer P, Perry L, et al. A single sleeping midnight cortisol has 100% sensitivity for the diagnosis of Cushing’s syndrome. Clin Endocrinol (1995) 43: 545 – 550
12. Nieman LK, Biller BM, Findling JW, Newell-Price J, Savage MO, Stewart PM, Montori VM. The diagnosis of Cushing’s syndrome: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab (2008) 93: 1526 – 1540
13. Papanicolaou DA, Mullen N, Kyrou I, Nieman LK. Nighttime salivary cortisol: a useful test for the diagnosis of Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab (2002) 87: 4515 – 4521
14. Papanicolaou DA, Yanovski JA, Cutler GB, et al. A single midnight cortisol measurement distinguishes Cushing’s syndrome from pseudo-Cushing’s states. J Clin Endocrinol Metab (1998) 83: 1163 – 1167
15. Pfaffe T, Cooper-White J, Beyerlein P, Koster K, Punyadeera C. Diagnostic potential of saliva: current state and future applications. Clin Chem (2011) 57: 675 – 687
16. Putignano P, Toja P, Dubini A, Pecori GF, Corsello SM, Cavagnini F. Midnight salivary cortisol versus urinary free and midnight serum cortisol as screening tests for Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab (2003) 88: 4153 – 4157
17. Raff H, Raff JL, Findling JW. Late-night salivary cortisol as a screening test for Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab (1998) 83: 2681 – 2686
18. Raff H. Role of salivary cortisol determinations in the diagnosis of Cushing syndrome. Curr Opin Endocrinol Diabetes (2004) 11: 271 – 275
19. Raff H. Salivary cortisol: a useful measurement in the diagnosis of Cushing’s syndrome and the evaluation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Endocrinologist (2000) 10: 9 – 17
20. Schwartz EB, Granger DA. Transferrin enzyme immunoassay for quantitative monitoring of blood contamination in saliva. Clin Chem (2004) 50: 654 – 656
21. Trilck M, Flitsch J, Ludecke DK, Jung R, Petersenn S. Salivary cortisol measurement a reliable method for the diagnosis of Cushing’s syndrome. Exp Clin Endocrinol Diabetes (2005) 113: 225 – 230
22. Voegtline KM, Granger DA. Dispatches from the interface of salivary bioscience and neonatal research. Front Endocrinol (2014) doi: 10.3389/fendo.2014.00025.
23. Yaneva M, Mosnier-Pudar H, Dugue MA, Grabar S, Fulla Y, Bertagna X. Midnight salivary cortisol for the initial diagnosis of Cushing’s syndrome of various causes. J Clin Endocrinol Metab (2004) 89: 3345 – 3351