Vyšetrenie náteru periférnej krvi

Vyšetrenie náteru periférnej krvi patrilo, patrí a aj naďalej bude patriť k neodmysliteľnému doplnku vyšetrenia krvného obrazu. Aj napriek rozvíjajúcej sa technológii krvinkových analyzátorov, keď tie najvýkonnejšie sú schopné vydať výsledok do 20 sekúnd a pritom spočítať viac ako 10 000 buniek, je niekedy nevyhnutná kvalitatívna kontrola. Hodnotenie krvných náterov je najrozšírenejšie morfologické vyšetrenie. Prispieva k vyhľadávaniu, k diagnostike a k monitorovaniu množstva ochorení. Na presnejšiu identifikáciu niektorých vývojových typov buniek je možné použiť cytochemické vyšetrenie, čiže zobrazenie niektorých enzymatických reakcií, ktoré prebiehajú v bunkách.

Prečo robiť mikroskopický náter?

Pri podozrení na patologické bunky vo vzorke (blasty, nezrelé granulocyty, aktivované, reaktívne alebo atypické lymfocyty a i.) vydávajú analyzátory hlásenia ako flagy. Takéto vzorky je potom nutné pozrieť mikroskopicky, pričom zo skúseností už vieme, že iba menej než 10 % týchto hlásení sa ukáže ako opodstatnených. Pri zvýšených monocytoch nad referenčnú hodnotu (viac ako 15 – 20 %) je tiež nutné pozrieť mikroskopický náter, či ide o patologické atypické formy monocytov, alebo ide o atypické formy lymfocytov, čo by analyzátor mohol nesprávne zdiferencovať. Vyšetrovanie krvného obrazu môže byť tiež ovplyvnené rôznymi inými bunkovými i nebunkovými faktormi, na ktoré analyzátor upozorňuje hlásením alebo poznámkami, ktoré sú špecifické pre jednotlivé typy analyzátorov. V týchto prípadoch tiež treba urobiť mikroskopickú kontrolu vzorky. Nesprávna analýza jedného parametra môže ovplyvniť analýzu iného parametra, preto treba poznať súvislosti medzi jednotlivými hodnotami krvného obrazu. Vďaka tomu predídeme vydávaniu chybných výsledkov. Na rozpoznanie jednotlivých druhov krviniek treba zhotoviť technicky bezchybný krvný náter. Nekvalitné nátery vedú často k chybným záverom alebo k prehliadnutiu patologického stavu. V našich laboratóriách sa krvné nátery robia zväčša na mikroskopických podložných sklíčkach, duplicitne v prípade potreby ďalšej diferenciálnej diagnostiky.

Kvantitatívnu a kvalitatívnu rovnováhu rozdielnych krvných buniek za normálnych okolností udržujú humorálne regulačné faktory ako rovnováhu medzi tvorbou buniek (najmä v kostnej dreni) a ich zánikom (hlavne v slezine a pečeni).

Kvalita náteru je pre hodnotenie buniek rozhodujúca, bunky sú dobre oddelené predovšetkým v záverečnej, koncovej časti náteru (náter urobený tzv. do stratena, kde morfológia buniek je veľmi dobre oddelená a bunky sú krásne viditeľné), pretože na jeho začiatku je oddelenie často menej dobré (náter je veľmi hrubý, bunky sa prekrývajú a nevidieť veľmi dobre morfológiu). Hoci cytomorfologické vyšetrenie samotné už často umožňuje priradenie bunky, napr. k myeloidnej vývojovej rade, má táto metóda predsa len svoje obmedzenia, hodnotenie môžu sťažiť tiež artefakty. Preto často nie je možné jednoznačné zaradenie buniek bez doplnenia postupu ďalšími diagnostickými metódami – cytomorfológiou v hematologicky zameranom laboratóriu, cytochemickým farbením a stanovením imunofenotypu multiparametrovou prietokovou cytometriou, ktorá umožňuje rozlíšenie rôznych bunkových populácií na základe priemeru buniek, ich granularity a antigénnych vlastností bunkového povrchu a cytoplazmy. Na tieto proteínové štruktúry sa dajú naviazať monoklonálne protilátky. Fluorescenčné označenie protilátok potom umožní s použitím laseru vyšetriť až niekoľko stoviek tisícov buniek za veľmi krátku dobu, čo umožňuje vysokú citlivosť stanovenia. Odporúča sa zvoliť panel protilátok pre daný prípad už na základe cytomorfologických a cytochemických nálezov.

Zhotovenie mikroskopického náteru

Kvapka krvi sa kvapne do stredu podložného sklíčka asi v jednej štvrtine od kraja sklíčka. Rozotierajúce sklíčko sa priloží pod uhlom 30 – 40 ° pred kvapku (krv sa pod vplyvom vzlínavosti rozprestrie po celom okraji sklíčka) a ľahkým, rovnomerným pohybom smerom ku kvapke a potom k opačnému koncu podložného sklíčka sa zhotoví náter. Náter musí byť rovnomerný, rovnorodý a primerane tenký, musí mať dlhé rovné okraje a cca 2 cm pred koncom sklíčka prechádzať do stratena. Hotový náter sa nechá na vzduchu dobre zaschnúť približne 1 – 2 hod.

Pre morfologické hodnotenie je rozhodujúci perfektný náter a veľmi záleží na správnej technike zhotovenia a farbenia náteru. Silu (hrúbku) náteru pri manuálnej metóde môžeme ovplyvniť uhlom, ktorý zviera rozotierajúce sklíčko s podložným sklíčkom. V súčasnej dobe najvhodnejšie nátery so štandardnou porovnateľnou úrovňou sa získavajú na náterových a farbiacich automatoch, z ktorých niektoré pri zhotovovaní náterov berú do úvahy hodnotu hematokritu.

Panoptické farbenie – používa sa kombinácia farbiacich techník. V jednej farbiacej kyvete býva väčšinou farbiaca zložka spoločne so zložkou fixačnou – väčšinou ide o zložku, ktorá farbí štruktúry, ktoré vykazujú afinitu k bázickým (zásaditým) farbivám. V druhej kyvete sú farbivá, ktoré majú výraznejšiu afinitu k acidofilným (oxyfilným) zložkám cytoplazmy alebo jadra.

Hodnotenie náteru periférnej krvi

Techniku určovania rôznych typov bielych krviniek zaviedol Paul Ehrlich v roku 1878, keď rozpoznával krvinky pomocou anilínových farbív. Techniku farbenia mikroskopických preparátov pomocou špeciálnych farbív zaviedol po prvýkrát Artur Pappenheim, ktorý používal anilínové farbivá s obsahom azúru.

Medzi hlavné zásady pre morfologické hodnotenie jednotlivých bunkových typov patrí, že sa prezerá a hodnotí celá bunka, jadro a cytoplazma. Prechody medzi jednotlivými vývojovými štádiami buniek sú plynulé, a preto nie je vždy jednoduché zaradiť určitú bunku do príslušnej kategórie. Musíme si uvedomiť i to, že žiadna charakteristika danej bunky nie je pre ňu striktne špecifická.

Vlastné hodnotenie vyšetrenia začína vždy prehľadným zhodnotením náteru a až potom nasleduje hodnotenie jednotlivých krvných buniek. Preparát treba posúvať tzv. meandrovitým (bajonetovým) pohybom s cieľom získať objektívny výsledok. Meandrovitý pohyb je nevyhnutný z dôvodu nerovnomerného rozloženia leukocytov, pretože bunky sa pri zhotovení náteru rozmiestnia podľa svojej veľkosti (menšie lymfocyty bývajú v strede, väčšie bunky napr. neutrofily a monocyty bývajú vytlačené na okraj). Rozpočet leukocytov sa vykonáva na 100 jadrových buniek v leukocytovom rade, pri patologických nálezoch sa hodnotí podľa okolností na 200 a viac buniek. Analyzátory nie sú schopné napríklad odlíšiť nesegmentované formy neutrofilov (tyčinky) od segmentovaných foriem. Toto odlíšenie je v súčasnej dobe možné vykonať len mikroskopickým hodnotením, pokiaľ sa neuvažuje o inej drahej technike stanovenia ako je napríklad imunofenotypizácia.

Nátery periférnej krvi hodnotí zdravotnícky laborant s praxou alebo špecializáciou v hematológii a transfúziológii. Výučba je podobne ako vo všetkých zdravotníckych povolaniach (odboroch) celoživotná. Je to tak nielen kvôli neustále sa vyvíjajúcim technológiám, vývoju a modernizácii pracovných postupov, ale hlavne kvôli tomu, že ak špecialista pracuje na úrovni prvého kontaktu, mal by vedieť jednoznačne posúdiť rozdiel medzi normálnym a patologickým nálezom. Nemôže robiť unáhlené závery a musí neodkladne informovať ošetrujúceho lekára, pretože diagnóza je komplexný proces. Lekár k nej dospieva syntézou údajov z anamnézy, fyzikálnych, laboratórnych a iných vyšetrení, aby mohol čo najskôr odoslať pacienta na vyššie špecializované pracovisko, kde budú môcť súbežne urobiť súbor nevyhnutných špeciálnych vyšetrení na potvrdenie alebo vylúčenie predpokladanej diagnózy.

Žiadanka o vyšetrenie mikrosko­pického náteru

Na žiadanke „ŽIADANKA O VYŠETRENIE − KLINICKÁ BIOCHÉMIA A HEMATOLÓGIA“ máme k dispozícii aj vyšetrenie „Diferenciál mikroskopicky“, ktorý má políčko na označenie zvýraznené ružovou farbou, čo znamená „Realizujeme na základe predchádzajúcej individuálnej dohody s kontaktným laboratóriom.“ Len máloktorá ambulancia nás kontaktuje, ale pokiaľ majú označené aj políčko DIFM, venujeme tomu pozornosť, skontrolujeme retrospektívne databázu, v prípade potreby kontaktujeme ambulanciu ordinujúceho lekára. V prípade, ak vyjde analýza krvného obrazu s diferenciálom v norme, vyradíme DIFM z procesu analýzy a napíšeme DIFM neindikovaný.

Záver

Na záver už len dodáme, že stanovenie mikroskopického náteru je aj v dnešnej dobe veľmi dôležité a pomáha nám pri určovaní správnej diagnózy, ukazuje nám, akým smerom sa máme uberať, aby sme čo najefektívnejšie a najrýchlejšie mohli dospieť ku správnej diagnóze u pacienta.

 

Hodnotenie článku

inVitro 2/2019

Adynamia, slabosť a únava

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 2/2019 Adynamia, slabosť a únava. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro