Vyšetrovanie imunofenotypizácie, fagocytózy a HLA v ambulantnej praxi

Laboratórna diagnostika bola a je podstatnou časťou diagnostického procesu v imunoalergológii. Preto je žiaduca – a samozrejme lekárom aj veľmi nápomocná – implementácia moderných či zmodernizovaných laboratórnych techník aj do každodennej praxe. Medzi takéto techniky patrí prietoková cytometria aj stanovovanie subtypov HLA.

Prietoková cytometria ako štandard

Jednou z metód na vyšetrovanie zložiek bunkovej imunity je prietoková cytometria. Bunky sú označené monoklonálnou protilátkou s naviazaným fluorochrómom a potom vyšetrované laserovým lúčom v cytometri. Výsledok je analyzovaný počítačovým softvérom a zobrazovaný ako histogram či bodový graf (dot plot).

Základnou prietokovou cytometriou získavame prehľad o zastúpení subtypov lymfocytov. CD3 znaky sa nachádzajú na všetkých lymfocytoch s receptormi TCRαβ. CD3 je základný diferenciačný znak T-lymfocytov, charakteristický pre všetky zrelé T-lymfocyty. Z populácie CD3+ T-lymfocytov ďalej diferencujeme tie so znakmi CD3+CD4+CD8- charakteristickými pre pomocné T-lymfocyty (Th –T helper) a CD3+CD4-CD8+ charakteristickými pre cytotoxické T-lymfocyty (Tc –T cytotoxic). CD4 a CD8 sú transmembránové glykoproteíny, pričom obe patria do veľkej imunoglobulínovej rodiny. Okrem toho sa z pomeru Th a Tc lymfocytov vypočítava CD4/CD8 ratio – imunoregulačný index, ktorého fyziologická hodnota má byť približne2.

CD16+56+ znaky sú charakteristické pre NK bunky (Natural Killer cells). Antigén 16 je nízkoafinitný receptor pre IgG, antigén CD56 je identický s NCAM-1 (Neural Cellular Adhesion Molecule 1). CD19+ je znak nachádzajúci sa na B-lymfocytoch všetkých  vývojových štádií okrem plazmatických buniek. Tiež je transmembránovým glykoproteínom, patriacim do veľkej imunoglobulínovej rodiny. (1) Sleduje sa aj aktivita lymfocytov, najčastejšie používaným je znak HLA-DR – pri sepse jeho nízka hodnota na monocytoch koreluje s horšou prognózou. Na T-lymfocytoch je exprimovaný najmä pri akútnych vírusových infekciách, na CD4+ lymfocytoch je extrémne vysoko exprimovaný pri hemofagocytujúcich syndrómoch.

Okrem toho sa cytometricky stanovujú aj iné aktivačné znaky lymfocytov, tiež podľa exprimovaných CD znakov je možné určiť ich vývojové štádiá. Cytometricky sa stanovujú nielen počty z periférnej krvi, ale aj zo vzoriek tkanív, bronchoalveolárnej laváže či napríklad likvoru. (V tomto článku rozoberám vyšetrenie z periférnej krvi, vzhľadom na to, že je najviac používané v imunologickej ambulantnej praxi.) Vo výsledkoch dodaných laboratóriom je nielen relatívny počet lymfocytov (v %) stanovujúci pomer v meraní iba z prietokového cytometra, ale aj absolútne hodnoty (bunky/µl), ktoré sa získavajú koreláciou z krvného obrazu z toho istého odberu (preto sa pri vyšetrení odoberá vždy aj krvný obraz). Indikáciou je najmä podozrenie na imunodeficit.

Závažné imunologické diagnózy na dlani

Z primárnych imunodeficitov je cytometria podstatná napríklad pri Brutonovej agamaglobulinémii, ktorá patrí do skupiny humorálnych imunodeficitov. Táto sa prejavuje už vo veku štyroch až šiestich mesiacov (po poklese materských protilátok), a to hlavne bakteriálnymi infekciami, najčastejšie opuzdrenými baktériami, a problémom môžu byť aj enterovírusy. Vyznačuje sa veľmi nízkou až nemerateľnou koncentráciou sérových imunoglobulínov (IgG, IgM a IgA), chýbaním odpovede špecifických protilátok, ale aj neprítomnosťou – alebo významným poklesom – cirkulujúcich B-lymfocytov (bez CD19+ a/alebo CD20+ buniek). (2) Bežný variabilný imunodeficit (common variable immunodeficiency, CVID) má podobné prejavy, avšak vzniká vo vyššom veku – v druhej až tretej dekáde života. Tiež sú charakteristické nízke koncentrácie imunoglobulínov (IgG pod 3g/l, IgA pod 0,05 g/l) a chýbajúca odpoveď protilátok, ale typicky s normálnymi počtami cirkulujúcich B-lymfocytov (> 2 %).  B-lymfocyty ale môžu byť aj znížené, pomer T-lymfocytov je často obrátený v prospech CD8+ (IRI je pod 1). Aj na klasifikáciu pacientov s CVID do podskupín podľa podtried B-lymfocytov môže byť použitá prietoková cytometria. Samozrejme, prietoková cytometria je dôležitou metódou i pri diagnostike bunkových a kombinovaných imunodeficitov.

Ťažký kombinovaný defekt imunity (Severe Combined Immunodeficiency, SCID) má rôznu etiológiu – genetické poruchy diferenciácie či funkcie T-lymfocytov však majú rovnakú kliniku, iba u podtypu ADA (autozomálne recesívny dedičný deficit adenozíndeaminázy) sa prejavujú príznaky skôr. Klinické prejavy sa objavia skoro po narodení – ťažké infekcie spôsobené vírusmi, intracelulárnymi i oportúnnymi mikroorganizmami. Jedným z klinických kritérií (u detí pod 2 roky) je hodnota CD3+ lymfocytov pod 20 % a koncentrácia lymfocytov pod 3000/mm3, tiež maternofetálny engraftment T-lymfocytov (prítomnosť materských lymfocytov, ktoré u imunodeficitných pacientov môžu vyvolať reakciu graft versus host, väčšinou nesú znak CD8+DR+). Prítomnosť podtried lymfocytov rozčleňuje SCID do viacerých kategórii, T-B+ tvorí cca 60 % SCID. Posudzuje sa tiež prítomnosť NK buniek. Medzi deficity T-B+NK- patrí napríklad deficit Janusovej kinázy 3 (JAK3), v prípade T-B+NK+ napríklad absencia reťazca alfa-receptoru pre IL-7 a spomedzi T-B-NK- je najčastejší ADA. Príkladom kombinovaných bunkových deficitov je pomerne vzácna idiopatická CD4 lymfopénia, u ktorej je koncentrácia CD4+ pod 300/mm3 pri absencii infekcie HIV a vylúčení iných lymfopénií. Klinické prejavy nastávajú o niečo neskôr než u SCID. Časté sú pridružené autoimunitné ochorenia, najmä krvi, často hnačkovité ochorenia, alergie a lymfoproliferatívne malignity.

U hemofagocytujúcich syndrómov (napríklad Chediak-Higashiho syndróm) pozorujeme polyklonálnu aktiváciu a proliferáciu T-lymfocytov vylučujúcich IFN-γ, čím aktivujú makrofágy. Nachádzame hlavne výrazné zastúpenie CD3+DR+ (nad 40 %, pancytopéniu a hypofibrinogenémiu). Takisto sú znížené bunky CD15+56+. Prejavujú sa horúčkou, splenomegáliou a končia multiorgánovým zlyhaním. U Di Georgeovho syndrómu, čo je vývojový defekt 3. a 4. žiabrovej výchlipky spojený s absenciou či redukciou týmusu a s ďalšími anatomickými anomáliami (hlavne srdca), je hlavným diagnostickým kritériom hladina T-lymfocytov CD3+ pod 500/µl. (3) 

Sekundárne imunodeficity

Okrem imunodeficitov sa so znížením CD3+ stretávame aj pri lymfopéniach, vírusových ochoreniach, sekundárnych lymfopéniach pri rádioterapii či chemoterapii. Pri niektorých vírusových ochoreniach však môže byť ich počet zvýšený, čo nachádzame aj pri niektorých lymfoproliferatívnych ochoreniach. U sekundárnych imunodeficitov je cytometria využívaná ako pomocná metóda pri HIV, keď je vyšetrením subpopulácií, najmä CD4+, možné určiť závažnosť, progresiu ochorenia, vhodnosť nasadenia antiretrovírusovej liečby či jej monitorovanie. Nielen pri AIDS ale napríklad aj pri imunosupresívnej terapii znamená pokles hodnoty CD4+ pod 200 buniek/µl riziko oportúnnej infekcie.  Zníženie CD4 môže okrem toho nastať aj pri sarkoidóze alebo nákaze helmintami. (4) Zvýšenie nachádzame napríklad pri reumatoidnej artritíde (CD4+CD28- bunky) či pri iných autoimunitných a infekčných ochoreniach. (5)

Obr.: Diferenciácia CD4+ a CD8+ T-lymfocytov v týmuse. Týmus (kôra, dreň) je pre vývoj T-lymfocytov kľúčovým orgánom, iba veľmi malá časť sa vyvíja mimo neho (pečeň, sliznica tráviaceho traktu). Celý proces vyzrievania je presne regulovaný a pravidelne podlieha kontrole o správnosti – neúspešný diferenciačný krok znamená vždy zastavenie ďalšej diferenciácie T-lymfocytov. Iba približne 3 % vyzrievajúcich lymfocytov podstúpia tento proces úspešne, ostatné hynú v procese apoptózy.

Zníženie CD8 lymfocytov je pozorované pri autoimunitných ochoreniach (zvýši sa však ich aktivita a produkcia protilátok) a niektorých vírusových ochoreniach. Počty CD8+ sa však zvyšujú aj pri vírusových ochoreniach, napríklad pri CMV (6), či pri sarkoidóze alebo nákaze helmintami. (4) Okrem vyššie uvedeného sledujeme aj pomer CD4/CD8, ktorý býva znížený pri HIV, anémii, skleróze multiplex, ťažkej myasténii a zvýšený pri infekcii a rakovine krvných buniek. Zvýšenie NK buniek je pri niektorých solídnych nádoroch, ich zníženie nastáva napríklad pod vplyvom kortikoterapie. Deficit je vzácny – treba ho preveriť pri recidivujúcich herpetických infekciách a nachádzame ho aj pri chronickom únavovom syndróme. (1)

Počty CD19+ sa znižujú napríklad pri chronickej imunosupresívnej či cytostatickej liečbe. Naopak ich premnoženie býva pri akútnej bakteriálnej infekcii, ale aj pri malignitách postihujúcich B-lymfocyty, hlavne pri chronickej lymfatickej leukémii. Vtedy býva normálna koncentrácia imunoglobulínov, pri myelóme nachádzame vysokú koncentráciu príslušného imunoglobulínu. (7)

Význam a poruchy fagocytózy

Cytometricky sa v dnešnej dobe merajú aj fagocytóza a oxidačný mechanizmus (vzplanutie), a to po predchádzajúcej kultivácii s rôznymi partikulami či mikroorganizmom (napr. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans). Indikáciou na stanovenie fagocytózy (výsledok v %) je podozrenie na poruchy neutrofilov (cyklická neutropénia, Kostmannov syndróm), aktínovej dysfunkcie (väčšinou navodené liečbou napríklad kolchicínom alebo cytostatikami), monitorovanie imunosupresívnej terapie (myelotoxické lieky, napríklad cyklofosfamid). Zníženie je i pri vyššom výskyte nezrelých foriem fagocytov. Pri použití mikroorganizmov testujeme čiastočne aj opsonizáciu. Stanovenie vzplanutia je dôležité najmä pri podozrení na chronickú granulomatózu. Sekundárne zníženie nastáva pri dialýze, liečbe rastovými faktormi, septických stavoch a expozícii toxickými látkami. (3)

HLA – trocha teórie

HLA (human leukocyte antigens) sú označením ľudských molekúl MHC (major histocompatibility complex). MHC 1. triedy sa vyskytujú na všetkých jadrových bunkách tela a existujú ich tri izotypy HLA-A, HLA-B a HLA-C. MHC 2. triedy sa fyziologicky vyskytujú len na bunkách prezentujúcich antigén (dendritické bunky, monocyty, makrofágy, B-lymfocyty), ich izotypy sú HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP. Ich funkciou je viazať a na povrchu bunky prezentovať fragmenty peptidov z proteínov, ktoré sú bunkou produkované (MHC 1) alebo pohltené (MHC 2). Okrem peptidov viažu aj niektoré chemicky modifikované peptidy, neklasické MHC aj lipidové molekuly.

Sú extrémne polymorfné, existuje mnoho alelových foriem, čiže aj rôznych štruktúr HLA, ktoré viažu rozličné peptidy. Delia sa kodominantne, preto majú ľudia na svojich bunkách dve alelické formy každého z antigénov HLA. HLA komplex sa nachádza na chromozóme 6. (8)

Choroby asociované s HLA

Zisťovanie HLA antigénov je podstatné v transplantológii, ale je dobrou pomôckou aj  u reumatologických ochorení. Asociácie s rôznymi ochoreniami sú početné, nie všetky však majú silné vzťahy k ochoreniu. Časté sú u autoimunitných chorôb či u chorôb nejasnej etiológie, kde však predpokladáme autoimunitné zapojenie. Asociácia je spôsobená buď ich funkciou (prezentovaním antigénu), alebo je nepriama.

HLA-B27 asociované s ankylozujúcou spondylitídou, Reiterovým syndrómom, reaktívnymi artritídami, psoriázou, ulceróznou kolitídou, Crohnovou chorobou, juvenilnými spondyloartropatiami, uveitídou a iridocyklitídou. Aj keď je frekvencia HLA-B27 u niektorých z týchto chorôb vysoká (97 % pacientov s ankylozujúcou spondylitítídou má HLA-B27), väčšina osôb, ktorá má tento antigén, je zdravá. Preto nález asociovaného HLA antigénu slúži na zvýšenie pravdepodobnosti diagnózy – hlavne v začiatkoch ochorenia či pri nejasnej diagnóze. V patogenéze zrejme zohráva úlohu interakcia medzi HLA-B27 a niektorými baktériami (šigely, chlamýdie, yersínie), pričom spúšťacím mechanizmom môžu byť cytotoxické T-lymfocyty reagujúce na prezentovaný antigén HLA-DR4, ktorý je asociovaný s reumatoidnou artritídou, a to s jej závažnejšími formami. Asociácia je tiež s HLA-DR1, respektíve s niektorými jej alelami. Ďalej je asociovaná aj s juvenilnou chronickou artritídou. HLA-B8, HLA-Dw3, HLA-DR3 sú asociované so Sjögrenovym syndrómom, aj keď v súčasnosti sa viac kladie dôraz na HL-DQ, ktorý je zrejme dôležitý aj v patogenéze ochorenia. Sekundárny Sjögrenov syndróm pri reumatoidnej artritíde je tiež asociovaný s HLA-DR4.

U systémovej sklerózy je silná asociácia s fibrózou pľúc a antigénom HLA-DR52. Aj u ďalších chorôb sa našli asociácie s antigénmi HLA. HLA-B51 a HLA-B52 sú asociované s Bechcetovou chorobou, HLA-DQ6 s narkolepsiou, HLA-DR2, DQ6 so sklerózou multiplex, HLA DQ8/DQ2 s juvenilným diabetom, HLA-Cw6 so psoriázou a HLA-B35 s autoimunitnou tyreoditídou. (9)

V imunoalergologických ambulanciách sa často stretávame s pacientmi s celiakiou, ktorí prichádzajú pre rôznorodé ťažkosti spojené s touto chorobou. V prípade diagnostických rozpakov je možné použiť aj diagnostiku HLA antigénov. U pacientov s celiakiou je silná asociácia s HLA-DQ2. Až 90 % celiatikov má takýto fenotyp, skoro všetci ostatní majú antigén HLA-DQ8.

Využívanie aj takýchto moderných metodík je dnes v ambulantnej praxi bežné a, samozrejme, aj mimoriadne užitočné v rámci diferenciálnej diagnostiky mnohých závažných klinických diagnóz. Je však dôležité všetky laboratórne nálezy vždy dôkladne posudzovať v súlade s klinickými nálezmi.
 


Literatúra:

  1. ADL-kolektív autorov: Laboratórna príručka, ADL s.r.o., Prešov 2007, ISBN 978-80-969818-0-9.
  2. Oliveira JB, Notarangelo LD, Fleisher TA: Applications of flow cytometry for the study of primary immune deficiencies., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2008 Dec; 8(6): 499 – 509. doi: 10.1097/ACI.0b013e328312c790.
  3. Bartůňková J., Šedivá A., Janda A.: Imunodeficiencie, 2., přepracované a doplněné vydání, 2007, Grada publishing, a. s., ISBN 978-80-247-1980-1.
  4. Kalinkovich A., Weisman Z., Greenberg Z., Nahmias J., Eitan S., Stein M., Bentwich Z.: Decreased CD4 and increased CD8 counts with T cell activation is associated with chronic helminth infection, Clin Exp Immunol. 1998 December; 114(3): 414 – 421. doi: 10.1046/j.1365-2249.1998.00736.
  5. Pawlik A., Ostanek L., Brzosko I., Brzosko M., Masiuk M., Machalinski B., Gawronska-Szklarz B.: The expansion of CD4+CD28-T cells in patients with rheumatoid arthritis, Arthritis Res Ther 2003, 5:R210-R213 doi: 10.1186/ar766
  6. Butz, E. A. M., Bevan, M. J.: „Massive Expansion of Antigen-Specific CD8+T Cells during an Acute Virus Infection“, Immunity, Volume 8, Issue 2, 167 – 175, 1 February 1998 doi: 10.1016/S1074-7613(00)80469-0
  7. Bartůňková J., Paulík M. a kol.: Vyšetřovací metody v imunologii, Grada publishing a.s., 2005, ISBN 80-247-0691-1
  8. Hořejší V., Bartůňková J.: Základy imunologie, Triton, 2009, ISBN 978807387-2809
  9. Bošák V.: „HLA systém a reumatické choroby“, Rheumatologia. Roč. 13, č. 1 (1999), s. 27 – 35
Hodnotenie článku

inVitro 1/2014

Imunológia a alergológia

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 1/2014 Imunológia a alergológia. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro