Postavenie a význam pracovísk patológie Alpha medical v oblasti gynekológie

Zameranie a možnosti laboratórií patologickej anatómie prechádzajú v posledných rokoch búrlivým rozvojom, ktorý je podmienený inovatívnou technikou či progresom informácií z oblasti genetiky. Keďže v reťazci Alpha medical existuje viacero pracovísk, ktoré sú zameraním svojej rutinnej činnosti rovnaké, avšak v niektorých špeciálnych vyšetreniach centralizované na základe odlišného prístrojového vybavenia, uvedený text si kladie za cieľ sprehľadniť súbor všetkých týchto vykonávaných aktivít.

Obrázok č. 1: Azda najznámejšou nositeľkou zmutovanej kópie génu BRCA1, ktorá zvyšuje riziko rakoviny prsníka i vaječníkov, je americká herečka Angelina Jolie. V roku 2013 prekvapila odvážným rozhodnutím, keď si nechala oba prsníky odstrániť.

ÚVOD

Patológia (patologická anatómia) sa po legislatívnych zmenách od roku 2004 – keď bola odčlenená pitevná (nekroptická) činnosť a pridelená Úradu pre dohľad nad zdravotnou starostlivosťou (UDZS) – zaoberá diagnostikou operačných materiálov v rámci bioptických, cytologických a iných špeciálnych laboratórnych metód. Alpha medical má ako materská spoločnosť svoje pracoviská patológie, ktoré pokrývajú územie celého Slovenska s diagnostickými centrami v Bratislave (Alpha medical patológia, s. r. o., Histopatologia, a. s.), Martine (Patológia, s. r. o.) s detašovaným pracoviskom v Banskej Bystrici a v Košiciach (HIS – DG, s. r. o.) vrátane iných detašovaných pracovísk hlavne pre poskytovanie peroperačnej biopsie.

 

BIOPSIA

Mikroskopické vyšetrenie predstavuje v súčasnosti nevyhnutnú a neodmysliteľnú súčasť diagnostiky ochorení patriacich do oblasti gynekologicko-pôrodníckej špecializácie. pracoviská patológie v rámci skupiny Alpha medical vyšetrujú materiál (tkanivá, časti orgánov alebo aj celé orgány) získaný na ambulancii alebo pri operácii – punkciou, sterom alebo spontánnym odlúčením z tela pacientov, vrátane exsudátov a iných telových tekutín (napr. krvi). V biopsii je pre gynekológov najčastejšie vyšetrovanie materiálov z maternice, čapíka (krčka) maternice, z ovárií a ostatných štruktúr reprodukčných orgánov ženského tela.

Obrázok č. 2: Elektrónmikroskopický obraz glomerulu

Určité medziodborové problémy v zaradení sa objavujú u materiálov z prsníka. Patológ vyšetruje materiál (z pohľadu diagnózy) nezávisle od klinika, ktorý ho odoslal. Nie je celkom definované presné klinické delenie problematiky. Operačné či punkčné materiály z prsníka dostávame od gynekológov aj od chirurgov. Preto problematiku diagnostiky ochorení prsníka prezentujeme aj v tomto čísle časopisu. Pomerne komplexnejšie je situácia riešená vo väčších nemocničných zariadeniach, a to organizovaním tzv. mamologických komisií, ktoré niekde pôsobia ako stále organizačné jednotky, inde ako dočasné komisie zriadené podľa potreby – ich členom býva aj patológ.

Vírus HPV (human papilloma virus) a jeho úloha pri dysplázii a karcinóme krčka maternice

V etiopatogenéze nádorov oblasti genitálu u žien (vulva, kŕčok maternice) a v perianálnej oblasti u oboch pohlaví sa najviac uplatňujú papilomavírusy ľudí (HPV, human papillomavirus). Papilomavírusy ľudí a zvierat sú malé neobalené vírusy (priemer 55 nm) obsahujúce dvojvláknovú DNA. Virióny (častice vírusu) majú ikozaedrovú symetriu; sú zložené zo 72 podjednotiek tvorených štruktúrnymi bielkovinami kapsidu (L1 a L2, označenie odvodené od slova late, t. j. neskoré bielkoviny). Vo vnútri kapsidu sa nachádza dvojvláknová ds DNA pozostávajúca z približne 8 000 bázových párov (bp). Tá okrem dvoch bielkovín kapsidu kóduje najmenej 7 (niekedy 8) neštruktúrnych proteínov označovaných ako E1 – E8 (odvodené od slova early, skoré bielkoviny). Súčasná klasifikácia HPV udáva najmenej 96 genotypov zadelených do rodov Alpha, Beta, Gamma, Mu a Nupapillomavirus (vyše 10 genotypov ostáva nezaradených). HPV sa totiž neklasifikujú na základe antigénovej príbuznosti, ale porovnaním sekvencií génu pre proteín L1. Jednotlivé genotypy sa zhodujú v géne L1 na 90 %, ich podtypy sú zhodné na 98 %, kým varianty jedného genotypu sa líšia iba v rozsahu menšom než 2 % nukleotidov (bp). Najviac genotypov HPV patogénnych pre ľudí prináleží rodu Alphapapillomavirus, do ktorého boli zadelené tzv. vysokorizikové genotypy, napríklad HPV-16, 18, 31, 33, 34, 34, 45 (HR-HPV, high risk HPV), ktoré s vysokou pravdepodobnosťou vyvolávajú dyspláziu dlaždicového epitelu čapíka maternice. Tá postupne prechádza do karcinómu krčka maternice. Málo rizikové genotypy vyvolávajú prevažne benígne nádorové ochorenia kože a slizníc (viď. Tabuľka č. 1).

Tabuľka č. 1: Klasifikácia papilomavírusov ľudí

Akútny replikačný cyklus papilomavírusov nastáva v nerohovatejúcom dlaždicovom epiteli sliznice genitálu a ústnej dutiny, ako aj v rohovatejúcom dlaždicovom epiteli kože. Pri akútnej infekcii čapíka maternice sa vírus rozmnožuje v bazálnych a suprabazálnych bunkách spinocelulárneho (dlaždicového) epitelu. Morfologickým znakom produktívnej replikácie je tvorba koilocytov. Koilocyty, ktoré majú charakteristické perinukleárne vakuoly pozorujeme v bunkových náteroch, aj v histologických rezoch. V jadre koilocytov vidno pri vyšetrení elektrónovým mikroskopom agregáty viriónov usporiadané do útvarov podobných mriežke (pri niektorých genotypoch sú základom inklúznych teliesok). Okolo viriónov vymizne chromatín, ktorý sa hromadí na vnútornej stene bunkovej membrány (nástenná hyperchromatóza). Vplyvom neštruktúrnych proteínov kódovaných vírusom nastáva hyperplázia buniek epitelu, čo sa prejavuje ako akantóza (hrotové výbežky zvlneného rozhrania epitelu oproti väzivu bez porušenia bazálnej membrány). Okrem toho nastávajú zmeny v produkcii keratínu (parakeratóza alebo hyperkeratóza), čo býva základom lézií aj pri špicatých kondylómoch (tzv. condylomata accuminata).

Zmeny pri infekcii HR-HPV pokračujú do dysplázie, ktorá podľa klasického delenia nastáva v 3 fázach. Pri CIN I (cervical intraepithelial neoplasia) je charakteristická dysplázia (zmena pomeru veľkosti jadra k objemu cytoplazmy) v rozsahu spodnej tretiny epitelu. Koilocyty sa vyskytujú najmä pri takomto miernom stupni dysplázie CIN I, ktorá sa chápe ako prvý stupeň vnútroepitelovej cervikálnej neoplázie. Niektorí však termín „neoplázia“ pre túto fázu infekcie HPV nepovažujú za výstižný, lebo ešte nejde o skutočné nádorové bujnenie hostiteľských buniek, ale len o ich imortalizáciu. Z uvedeného dôvodu preferuje časť autorov spoločný termín SIL (squamous intraepithelial lesion) – pri stupni CIN I zodpovedá štádiu LSIL (low grade squamous intraepithelial lesion). V tomto štádiu je v epiteli prítomná DNA HPV, ktorú možno v bioptickom materiáli alebo v náteroch preukázať metódou hybridizácie in situ. V extraktoch z odobratého materiálu sa vírusová DNA dokazuje metódou PCR (polymerázová reťazová reakcia) alebo metódou vychytania DNA (hybrid capture, HC-2) pomocou fragmentov komplementárnej RNA. Metódou označených protilátok je možné dokázať prítomnosť antigénov kódovaných HPV, čo je však v parafínových rezoch pomerne náročné a menej citlivé ako dôkaz vírusovej DNA (vDNA).

Pri časti rýchle postupujúcich prípadov dysplázie CIN I nastane prechod do fáz CIN II/CIN III, ktoré znamenajú premenu celého epitelu a v konečnom dôsledku znamenajú prekancerózny stav. Inokedy sa infekcia so známkami CIN I/LSIL spontánne vyhojí, alebo prechádza do chronickej (latentnej) fázy. Niektoré štúdie na veľkých súboroch pacientok, u ktorých bol diagnostikovaný stupeň CIN II alebo CIN III, zistili pretrvávajúcu latenciu HR-HPV DNA po dobu najmenej 12 mesiacov, často aj omnoho dlhšie. Prepis vírusových génov (syntéza vírusovej mRNA) je riadený promótormi v dlhej kontrolnej oblasti (LCR, long control region) vírusovej DNA (vDNA). Ku kontrolnej oblasti vDNA ležia najbližšie čítacie rámce génov, ktoré kódujú neštruktúrne onkogénne bielkoviny E5, E6 a E7. Toto usporiadanie génov má rozhodujúci význam pre ich onkogénny účinok, ktorý sa prejaví, keď sa neúplný fragment vDNA integruje (včlení) do DNA hostiteľskej bunky. Integrácia úseku HPV DNA kódujúceho proteíny E6/E7 do niektorého chromozómu hostiteľskej bunky je predpokladom nekontrolovanej expresie uvedených proteínov, ktoré vážne zasahujú do regulácie cyklu delenia hostiteľských buniek. Reagujú totiž s dvoma kľúčovými proteínmi regulujúcimi bunkové delenie. Nastáva interakcia E6 s proteínom p53 a interakcia E7 s proteínom Rb (retinoblastómový proteín). Vysoká miera expresie proteínu E7 pri stupni CIN II/HSIL (HSIL – high grade squamous intraepithelial lesion) spôsobuje prechod dysplázie do CIN III/HSIL. Proteín p16/INK4A (inhibitor kinase 4) je inhibítor bunkového delenia (v konečnom dôsledku inhibuje aktiváciu Rb), ktorého syntéza stúpa v prítomnosti onkoproteínu E7. Za fyziologických okolností p16 inhibuje cyklín dependentné kinázy (cdk4/6) asociované s bunkovými cyklínmi, najmä cyklínom D1. V dysplastických bunkách sa bielkovina p16/INK4 tvorí v nadbytku, čo bezprostredne súvisí s prechodom na trvalú schopnosť deliť sa (imortalizácia bunky). Expresiu proteínu p16 je možné pozorovať v jadrách, ako aj v cytoplazme dysplastických buniek dlaždicového epitelu a samozrejme aj v bunkách karcinómu. Zreteľné pozitívne farbenie antigénu p16 sa vyskytuje v bazálnych a suprabazálnych bunkách okolitého nerohovatejúceho dlaždicového epitelu, ak nesie znaky CIN I/LSIL (pravdepodobnosť až do 80 %). Pri dysplázii CIN II/HSIL, ako aj CIN III/ HSIL sa antigén p16 vyskytuje s veľmi vysokou pravdepodobnosťou (95 až 100 %). Typickým znakom CIN II/HSIL je distribúcia antigénu p16 vo viac ako jednej tretine zmeneného epitelu, respektíve až difúzna lokalizácia v celej jeho šírke (CIN III/HSIL). Intenzívne farbenie na proteín p16 je možné pozorovať i v jadrách a v cytoplazme nádorových buniek karcinómov krčka maternice (viď. Obrázok č. 3). Farbenie na antigén p16 je teda dobrou diagnostickou pomôckou, ktorá upozorní na prítomnosť dysplázie, ako aj na jej rozsah v rezoch pripravených z bioptického materiálu odobratého pri konizácii čapíka.

Obrázok č. 3: IHC p16 v dysplatickom dlaždicovom epiteli krčka maternice

Nádory prsnej žľazy

Bioptické vyšetrenie – prínos

Karcinóm prsníka patrí medzi onkologické ochorenia, pri ktorých sa dnes už rutinne používajú viaceré prediktívne markery. Rozdelenie pacientov do prognostických skupín podľa týchto markerov – pri použití ďalších kritérií ako sú veľkosť nádoru, stupeň (grade), angioinvazivita a metastatické postihnutie axilárnych lymfatických uzlín – predstavuje základ pre zvolenie liečebných postupov tohto závažného ochorenia.

Hormonálne receptory

a) Estrogénové receptory (ER)
Estrogénové receptory sú považované za veľmi silný prediktívny marker. Exprimujú sa približne v 60 % karcinómu prsníka u žien mladších ako 50 rokov a až v 80 % u žien starších ako 50 rokov. ER zohrávajú dôležitú úlohu v karcinogenéze, a preto je inhibícia ER súčasťou liečby tohto ochorenia. Karcinómy prsníka s fenotypom ER+ a/alebo PR+ majú výrazne nižšiu mortalitu v porovnaní s nádormi, ktoré sú ER- a/alebo PR-.

b) Progesterónové receptory (PR)
Expresia týchto receptorov poukazuje na funkčnú aktivitu estrogénového mechanizmu, a tým aj na možnosť odpovede a hormonálnu liečbu i pri nižšej hladine ER alebo falošnej negativite.

c)  Androgénový receptor (AR)
AR sa zdá byť najčastejšie exprimovaným steroidným receptorom v karcinóme prsníka. U najbežnejších luminálnych karcinómov sa AR vyskytuje približne v 70 – 80 % prípadov a pozitivita koreluje s nízkym gradingom a celkovo priaznivejšou prognózou. Dokonca aj u nádorov ER- je AR exprimovaný v 30 – 50 %. AR tiež ovplyvňuje indikáciu cieľovej terapie, čím zároveň šetrí pacientky od toxických účinkov nešpecifickej chemoterapie.

Proliferačná aktivita – využiteľné markery

Ki-67 je proliferačný marker, ktorý farebne znázorňuje jadrá buniek vo všetkých fázach bunkového cyklu okrem pokojovej fázy. Pozitivita sa hodnotí semikvantitatívne v percentách, keď nízka proliferačná aktivita (5 – 15 %) svedčí pre pomalý rast nádorov, a tým aj lepšiu prognózu.

Menej často sa používajú iné markery, napr. PCNA (proliferating cell nuclear antigen).

E-kadherín zohráva významnú úlohu v intercelulárnej adhézii epiteliálnych buniek. Absencia E-kadherínu je pozorovaná v rozličných karcinómoch vrátane karcinómu prsníka a spája sa s progresiou ochorenia (napr. lobulárny karcinóm prsníka exprimuje slabú pozitivitu alebo pozitivita na E-kadherín úplne chýba).

Survivín – výrazná expresia tohto proteínu (najmä jadrová alebo zmiešaná jadrová a cytoplazmatická expresia) sa spája s horšou prognózou pacientov a zníženou odpoveďou na chemoterapiu.

HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, synonymá: HER2/neu, c-erbB-2) – do 90. rokov minulého storočia bola imunopozitivita zvyšnej expresie HER2 považovaná za zlý prognostický znak. Zavedením trastuzumabu do liečby sa však z čisto prognostického markera stal aj významný prediktívny faktor. Jeho vyšetrenie sa stalo zásadným pre výber pacientok, ktoré sú vhodné pre liečbu trastuzumabom. Preto už viac rokov platí, že popri dôkazu hormonálnych receptorov a proliferačných markerov, má byť HER2 vyšetrenie robené pri všetkých novodiagnostikovaných karcinómoch prsnej žľazy.

HER2 je možné vyšetriť imunohistochemicky a pomocou ISH (FISH, CISH, SISH). V prípadoch, ktoré sú hodnotené imunohistochemicky 2+ a 3+, má byť následne urobené vyšetrenie ISH, ktoré potvrdí, či je gén amplifikovaný (tieto prípady sú vhodné na cielenú terapiu) alebo nie (liečba trastuzumabom nie je indikovaná). Pri skóre 0 a 1+ sa imunovyšetrenie považuje za negatívne.

Mismatch repair proteíny (MMRP)

Strata funkcie jedného alebo viacerých reparačných proteínov má za následok zvýšenie mutácií a je asociovaná so zvýšeným rizikom vzniku zhubného nádoru vrátane nádorov prsnej žľazy. Tieto mutácie spôsobujú produkciu abnormálne krátkych alebo inaktivovaných proteínov, ktoré nemôžu vykonávať ich normálnu funkciu – opraviť chyby v DNA behom replikácie buniek. Z tohto pohľadu sú najdôležitejšie MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2. Strata expresie jedného alebo viacerých proteínov svedčí pre defektný DNA reparačný systém, čoho následkom je aj tzv. mikrosatelitová instabilita. Preto je MMRP systém veľmi dôležitý pri udržiavaní genómovej stability a prevencie vzniku malígnych nádorov. Vyšetrenie hore uvedených proteínov má preto veľký význam v patogenéze nádorových ochorení a poskytuje dôležité a zásadné informácie zainteresovaným odborníkom. U človeka bolo dokázaných niekoľko stoviek MMRP mutácií, ktoré ľudí predisponujú k vzniku malígnych nádorov.

BRCA – pomocník alebo strašiak žien?

Na Slovensku sa ročne diagnostikuje skoro 25 000 nových onkologických prípadov, z ktorých u žien dominujú karcinómy prsníka. Je alarmujúce, že i napriek osvete, vyspelej diagnostike a najmodernejším liečebným postupom pribudne na našich ambulanciách viac ako 2 500 diagnostikovaných žien ročne a skoro 700 tomuto ochoreniu aj podľahne. Tieto čísla naznačujú, že na Slovensku neexistuje rodina, ktorá by priamo alebo nepriamo nebola dotknutá týmto ochorením. Predpokladom efektívnej a účinnej kontroly tohto ochorenia je včasná a detailná diagnostika, teda činnosť, na ktorú sa špecializujeme.

Karcinómy prsníka sú heterogénne ochorenia združujúce niekoľko desiatok histotypov, ktoré sú identifikovateľné na našich histologických prevádzkach. Táto rutinná diagnostika okrem iného spoľahlivo odhalí, či ide o karcinóm s aberantnou expresiou estrogénových, progestrogénových alebo HER2/neu receptorov a nasmeruje terapeutický proces. Proteínové receptory a ich expresia na povrchu malígnych buniek sa študuje immunohistochemickými metódami, ktoré podliehajú prísnej kontrole kvality v plne automatizovaných moduloch. Výstupom tohto procesu je spracované suspektné tkanivo, ktoré hodnotí patológ. Z takto určenej primárnej diagnózy však nie je jasné, či ide o sporadicky sa vyskytujúce alebo dedičné ochorenie. Ženy s potvrdenou predispozíciou na ochorenie karcinómu prsníka sa po konzultácii s klinickým genetikom môžu edukovane rozhodnúť pre optimálne manažovanie ich zdravotného stavu. Predpokladá sa, že na Slovensku existuje z celkového počtu novodiagnostikovaných karcinómov prsníka 5 – 10-percentná skupina, u ktorej zohrávajú úlohu pri vzniku tohto ochorenia dedičné faktory. Tento pomer predstavuje na Slovensku 125 – 300 žien ročne, ktoré by mohli benefitovať z genetického poradenstva. Multidisciplinárna spolupráca medicínskych profesií je preto predpokladom pre optimálnu kontrolu tohto ochorenia.

Na našich prevádzkach je interakcia medzi patológmi, molekulárnymi biológmi a klinickými genetikmi samozrejmosťou a spoločným úsilím sa snažíme transformovať najnovšie klinicky dôležité poznatky do praxe. Jedným z priesečníkov, ktorý nás združuje, sú aj onkomarkery BRCA, v plnom znení breast cancer susceptibility gene = nádorový supresorový gén. V ľudskom organizme plnia – okrem iného – funkciu tumorových supresorov. BRCA1 and BRCA2 sú multifunkčné proteíny, ktoré putujú do jadra bunky, kde sa podieľajú napríklad na oprave dvojšpirálových DNA zlomov pomocou homológovej rekombinácie sesterských chromatidov alebo na kontrole bunkového cyklu. Obidva procesy sú kritické pre udržanie homeostázy bunkového delenia a integrity i funkčnosti prsníkového parenchýmu. BRCA1 a BRCA2 spolupracujú s ďalšími tumorovými supresormi a vytvárajú proteínové komplexy na DNA špirále, ktoré regulujú génovú expresiu ďalšej plejády proteínov vo fyziologickom kontexte. Funkčné BRCA1 a BRCA2 sú teda „hliadkovačmi“ a kontrolórmi patologických procesov na bunkovej úrovni a spolu s ďalšími proteínmi zabraňujú nekontrolovateľnému bujneniu v prsníku. U žien s genetickou predispozíciou na ochorenie karcinómu prsníka neplnia BRCA1 a BRCA2 svoju funkciu v plnom rozsahu, čo môže viesť k malígnemu procesu s manifestáciami viditeľnými pri odbornom vyšetrení.

Každá žena zdedí genetickú výbavu od svojich rodičov a tá predstavuje aj dve kópie BRCA1 a BRCA2 génov. Práve tieto mutované gény sú, ako jedny z mála, preukázateľne asociované s genetickou predispozíciou karcinómu prsníka. To, či tieto génové kópie vyšetrovanej ženy predstavujú riziko ochorenia karcinómu prsníka, sa dá preveriť v laboratóriách nášho typu, napríklad komplexne a pomocou DNA sekvenácie. BRCA1 a BRCA2 sú zložitejšie a pomerne dlhé gény pozostávajúce z 23 a 27 exónov – jednotiek kódovacích proteín. Mutované a teda patologické časti BRCA1 a BRCA2 nie sú zoskupené do špecifických regiónov, ale sú roztrúsené po celej kódovacej jednotke a pre BRCA1 a BRCA2 predstavujú niekoľko stoviek aberácii, ktoré je u žien s neznámou genetickou predispozíciou potrebné vyšetriť. Testovanie takýchto dlhých úsekov DNA bolo do príchodu nových technológii časovo, metodicky a finančne náročné a vyžadovalo si tímový laboratórny prístup. Nová platforma na báze ďalšej generácie sekvenovania (next generation sequencing) predstavuje vylepšenie viacerých parametrov testovania vrátane senzitivity, rýchlosti, dostupnosti a časovej náročnosti vyšetrenia. Navyše sú k dispozícii aj klinicky overené vyhodnocovacie počítačové programy umožňujúce rýchlejší obrat vygenerovaných dát, i keď manuálny prístup ku každému vyšetrenému klinickému materiálu nie je možné odbúrať a je pre nás prioritou.

Na testovanie sa používa niekoľko mililitrov plnej krvi, podobne ako pri určovaní krvného obrazu, v dôsledku čoho predstavuje táto metodika neinvazívne a rýchle zistenie mutovaného, respektíve nemutovaného profilu probandky. Výstupom takéhoto vyšetrenia je komplexné zhodnotenie DNA profilu BRCA1 a BRCA2, na základe ktorého uzavrie klinický genetik – spolu s klinickými údajmi testovaného probanda – predispozíciu na ochorenie karcinómu prsníka. V našom laboratóriu máme najmodernejšiu BRCA1 a BRCA2 sekvenáciu novej generácie úspešne odskúšanú a po zvládnutí legislatívnych úskalí ju plánujeme ponúkať už v blízkej budúcnosti.

 

CYTOLÓGIA

Najúčinnejšou a z ekonomického hľadiska aj najlacnejšou obranou proti rakovine krčka maternice je jej včasné odhalenie. Dnes je všeobecne najúčinnejšou metódou cytologické vyšetrenie materiálu odobratého sterom z krčka maternice. Pomocou cytologického skríningu môžeme odhaliť mnoho patofyziologických zmien na bunkách krčka maternice, od zápalových a dysplastických zmien až po hormonálne poruchy.

PAP test

PAP test je tiež nazývaný Papanicolaou test a v anglosaskej literatúre je označovaný ako cervical smear – výter z krčka maternice. Je to skríningový test slúžiaci na detekciu potenciálnych prekanceróz, čiže začínajúcich predrakovinových stavov krčka maternice a endocervikálneho kanála. Tento test je pomenovaný podľa svojho objaviteľa, významného gréckeho lekára, Georgea N. Papanicolaoua (1883 – 1962), ktorý v roku 1928 vyhlásil, že malígne bunky z cervixu môžu byť identifikované z náteru krčka maternice. Odvtedy sa táto rýchla a neinvazívna metóda začala šíriť a masívne využívať vo všetkých štátoch sveta, ako jedna z mála evidentne preukázala súvislosť medzi systematickým skríningom a výskytom rakoviny krčka maternice. Zatiaľ ide o najrozšírenejšiu a najlacnejšiu skríningovú metódu. V krajinách, kde je zavedený systematický skríning, je preukázateľne nižšia úmrtnosť na rakovinu krčka maternice.

Adekvátnosť vyšetrenia vzorky

Pre dostatočné vyhodnotenie sterov odobratých z krčka maternice za účelom prevencie a diagnostiky prekanceróz je potrebné dokonalé posúdenie všetkých zorných polí na danom preparáte. Toto je možné len z dôkladne spracovaného materiálu. Na zabezpečenie čo najlepších podmienok skríningu sa musí dbať už pri odbere biologického materiálu z krčka pacientky gynekológom. Krčok maternice sa pred odberom nevytiera ani nijak inak neošetruje, aby ster obsahoval dostatočne veľké množstvo buniek. Odber materiálu sa vykonáva sterom z povrchu (exocervixu) aj hrdla (endocervixu) krčka maternice ľahkým krúživým pohybom. Takto odobratý materiál sa následne natrie na podložné sklíčko. Oba stery, z exocervixu a endocervixu, by sa mali natierať ako dva samostatné materiály na dve podložné sklíčka. Stery by mali byť rovnomerné a tenké. Hrubý náter sa nedá jednoznačne hodnotiť kvôli poprekrývaným bunkám vo viacerých vrstvách. Sklíčko sa po odbere ihneď fixuje 96-percentným alkoholom, prípadne iným komerčne dostupným fixačným roztokom. Aby nedošlo k zámene materiálu s inou pacientkou, je potrebné podložné sklíčko označiť a značku zaznamenať aj na sprievodný list. Spoľahlivosť vyšetrenia je do veľkej miery ovplyvnená správne vykonaným odberom a správnou fixáciou. Znemožniť hodnotenie cytologického obrazu môže aj nesprávne farbenie, zakrvácanie materiálu (obr. 3).

Obrázok č. 4: Masívne zakrvácané preparáty viditeľné aj voľným okom

K častým chybám patrí aj nízka bunkovitosť. Pri dostačujúcej bunkovitosti sa hodnotí prítomnosť exocervikálnych a endocervikálnych komponentov. Niekedy sa pri plytkom odbere nezachytia endocervikálne komponenty. Preto je nutný hlbší ster, ktorý bude zasahovať cez transformačnú zónu, ktorá je najrizikovejšou lokalizáciou prekanceróznych zmien.

Cytologický ster musí byť vhodne odobraný, správne fixovaný a dobre ofarbený. Vtedy ho označíme ako vhodný pre interpretáciu. (viď. Obrázok č. 5 a Obrázok č. 6)

Obrázok č. 5: Ster vhodný na interpretáciu – dobre fixované bunky, ostré kontúry, korektné farbenie, dostatočná bunečnatosť
Obrázok č. 6: Ster nevhodný na interpretáciu – nedostatočná fixácia, nedostatočné množstvo buniek, slabé kontúry

Žiadanka na cytologické vyšetrenie

Bez žiadanky na cytologické vyšetrenie sa preparát do laboratória nedostane, pretože takýto preparát nie je možné do laboratória prijať a ďalej spracovať. Žiadanka k biologickému materiálu musí byť starostlivo vyplnená a musí obsahovať nevyhnutné informácie o pacientke a niekoľko doplnkových údajov, ktoré sú pre cytodiagnostiku dôležité z hľadiska procesu diagnostiky.

Základné údaje:

  • meno a priezvisko pacientky,
  • rodné číslo pacientky,
  • adresa pacientky,
  • číslo poisťovne alebo iná forma úhrady,
  • identifikácia ordinujúceho lekára, jeho kód a pracovisko (pečiatka, podpis),
  • číslo sklíčka, ktoré súhlasí s číslom na žiadanke, aby sa predišlo zámene pacientok,
  • dátum odberu,
  • klinická diagnóza.

Doplnkové údaje:

  • posledná menštruácia,
  • cyklus – pravidelný, nepravidelný, amenorea, klimaktérium,
  • zavedené IUD,
  • gravidita,
  • laktácia,
  • užívanie HA,
  • predchádzajúce zákroky.

Pri hodnotení jednotlivých prípadov si všímame tieto základné a doplnkové údaje, o ktoré sa môžeme oprieť, alebo na základe ktorých vydávame odporúčania klinickému lekárovi. Ten následne rozhodne o ďalšom liečení pacientky.

Klasifikačný systém BETHESDA

BETHESDA je systém klasifikácie cytologických lézií, ktorý bol prijatý na konferencii v meste Bethesda v štáte Maryland (USA), odkiaľ pochádza aj jeho názov. Používa sa pri prehľadnom a rýchlom zapisovaní výsledkov v gynekologickej cytodiagnostike. Je to jednotný systém terminológie a klasifikácie lézií, ktorý sa používa v komunikácii medzi laboratóriami a lekármi – klinikmi. Jeho prijatie bolo výsledkom zosúladenia širokej škály názorov a záujmov všetkých zainteresovaných v diagnostickom procese, teda patológov, cytotechnológov a gynekológov. Poskytuje jasné pokyny a odporúčania ďalších vyšetrení, a tým medzi nimi zabezpečuje dokonalú komunikáciu. Zahŕňa nielen popisné diagnózy, ale aj vyjadrenia k adekvátnosti vyšetrenia z odobratej vzorky a jej vhodnosti pre interpretáciu. V roku 1991 bol Bethesda systém revidovaný po prvýkrát a naposledy to bolo v roku 2001. V takej forme ho poznáme a používame dodnes.

HPV infekcia a cervikálne lézie

V súčasnosti už vieme, že HPV (Human Papilloma Virus) je základným etiologickým faktorom rakoviny krčka maternice. Bez HPV sa síce môžu v sliznici maternicového krčka vyvíjať, v dôsledku iných infekcií epitelu ľahké dysplastické zmeny, nevznikne však karcinóm. Podrobnosti o vírusoch HPV a patogenéze ním vyvolaných dysplastických a nádorových zmien sú uvedené v texte o bioptickom vyšetrení. Podľa možného onkogénneho pôsobenia na epitel čapíka maternice sa genotypy HPV delia na nízkorizikové (low-risk) a vysokorizikové (high-risk).

Nízkorizikové typy – low risk HPV: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 – spôsobujú vznik benígnych útvarov na sliznici (tzv. kondylómov).

Vysokorizikové typy – high risk HPV/HR-HPV: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, z nich najčastejšie rizikové genotypy 16, 18, 31, 33, 45 boli identifikované u troch štvrtín karcinómov.

Detekcia DNA HPV vo vaginálnom sekréte, respektíve v extraktoch bunkových náterov alebo kondylómov je možná pomocou troch testov. Klasická je polymerázová reťazová reakcia (PCR), pri ktorej sa amplifikuje (znásobí) počet molekúl vírusovej DNA. Pri nej sa používajú krátke oligonukleotidy, tzv. primery, ktoré obvykle detegujú spoločné a pre jednotlivé genotypy špecifické úseky génu L1. Modifikáciou tejto techniky je reakcia PCR sledovaná vo svojom časovom priebehu (real time PCR). Treťou možnosťou je použitie hybridizačnej RNA sondy, ktorá hybridizuje s vírusovou DNA (vDNA). Komplex vDNA/RNA sa z tekutého extraktu vychytá pomocou protilátky naviazanej na stenu mikrotitračnej doštičky. Potom nasleduje vizualizácia reakcie pomocou označených protilátok a pridaného substrátu. Test novej generácie HC2 (Digene) sa považuje za rovnako citlivý ako test real time PCR (napr. test AMPLICOR monitor Roche), keďže deteguje 1 až 2pg HPV DNA v ml vzorky.

Obrázok č. 7: LSIL zväčšené jadrá, hyperchromázia, jemné zhrubnutie chromatínu, dvojjadrovosť a mierna strata ostrých kontúr jadrovej membrány

LSIL (Low-grade squamous intraepithelial lesion) – CIN I 

LSIL je nízkoriziková intraepitelová lézia, ktorá je spôsobená veľkým počtom odlišných ľudských papilomavírusov, nízko i vysokorizikových typov. LSIL je lézia intermediálnych a superficiálnych buniek dlaždicovitého epitelu. Je charakteristická miernym stupňom bunkových atypií s nízkym stupňom rizika vzniku dlaždicovo-bunkového karcinómu a predstavuje reverzibilný proces (obr. 7).

HSIL (High-grade sqamous intraepithelial lesion) – CIN II, CIN III

Ide o léziu s postihnutím všetkých vrstiev dlaždicovitého epitelu, charakterizovanú výrazným stupňom atypií, s vysokým rizikovým potenciálom prechodu do karcinómu z dlaždicových buniek. Táto kategória zodpovedá histologickému obrazu strednej až ťažkej dysplázie – CIN II a CIN III. Dlaždicové bunky sú výrazne zmenené oproti miernym zmenám pri LSIL. Charakteristickou črtou je výrazné zväčšenie a hyperchromázia jadier, nepravidelnosť a zriasenie jadrovej membrány, zrnitý chromatín, zmena nukleo-cytoplazmatického pomeru výrazne v prospech jadra a zhlukovanie dysplastických buniek do tzv. klastrov. Tieto výrazné bunkové atypie, pri ktorých vznikajú jadrá rôzneho tvaru a veľkosti, sú často sprevádzané zakrvácaným pozadím preparátu, ktoré je spôsobené zmenou fragility dysplastického epitelu.

Názvoslovie dysplázie pri bioptickom vyšetrení (CIN = cervical intraepithelial neoplasia) sa odlišuje od názvoslovia cytologického hodnotenia (SIL = squamous intraepithelial lesion). Stupeň CIN I sa prakticky zhoduje s označením nízkeho stupňa SIL (LSIL, low grade SIL). Stupne dysplázie CIN II a CIN III zodpovedajú vyššiemu stupňu atypie buniek v cytologických náteroch hodnotených ako HG SIL (high grade SIL). Kým stupeň CIN I/LSIL sa všeobecne nepovažuje za prekancerózny stav, stupeň CIN II/HSIL a najmä stupeň CINIII/HSIL treba považovať za vážne ohrozenie zdravotného stavu, ktoré môže viesť k vzniku malígneho karcinómu. Ako ukazuje schéma, stav CIN I/LSIL sa považuje za miernu dyspláziu, stavy HSIL (CIN II ako aj CIN III) predstavujú stredne ťažké až veľme ťažké formy dysplastických zmien, ktoré prechádzajú do vlastného karcinómu.

V niektorých prípadoch nachádzame zväčšené bunky v cytologickom obraze, pri kolposkopicky negatívnom náleze. Tieto bunky majú vzhľad atypických buniek s výrazne zväčšeným a hyperchrómnym jadrom, avšak bioptický nález nezodpovedá dysplázii vyššieho stupňa. Ide zväčša o reziduálny nález po prekonanej HPV infekcii, keď ostávajú predovšetkým v povrchových vrstvách dlaždicovitého epitelu prítomné zmeny na jadrách buniek. Samostatnú skupinu nálezov pri cytologickom vyšetrení tvorí kategória atypických dlaždicových buniek nejasného významu (ASCUS, atypical squamous cells of unknown significance), ktoré si môže patológ pomýliť s reaktívnymi zmenami odlúpnutých buniek epitelu pri nešpecifických zápaloch rozličného pôvodu. Aj nálezy ASCUS, ako aj LSIL si vyžadujú vyšetrenie na DNA HPV. Podľa veľkej štúdie uverejnenej v roku 2002 v časopise JAMA bolo v USA dlhodobo sledovaných vyše 4 000 žien – dobrovoľníčok vo veku medzi 25 až 45 rokov na prítomnosť HPV DNA a súčasne bol u nich opakovane vyšetrený cytologický nález v steroch čapíka (krčka) maternice. Cytológia aj vírusová DNA boli negatívne pri 65 % sledovaných žien (2 631/4 057). Aspoň jeden pozitívny parameter bol prítomný pri zvyšných 35 % dobrovoľníčok. Z toho vDNA bez cytologických zmien bola prítomná pri 17 % (687 prípadov zo 4 057), kým kombinácia vírusovej DNA a mierne pozitívnej (LSIL), respektíve podozrivej cytológie (ASCUS) sa našla pri 7,3 % (298 prípadov zo 4 057). Skoro rovnako často (v 9,3 % prípadov) sa vDNA nedala preukázať napriek podozrivej cytológii ASCUS, respektíve nálezu LSIL (377 prípadov zo 4 057). Sledovanie oboch parametrov pri skupine DNA plus/LSIL ukázalo, že sa v 56 prípadoch potvrdil prechod do predmalígneho štádia CIN III/HSIL, čo predstavuje takmer 20 % zúčastnených osôb. V skupine vDNA mínus/ASCUS respektíve vDNA mínus/LSIL sa štádium CIN III vyvinulo len v 7 prípadoch, čo predstavuje 3 % pôvodného počtu dobrovoľníčok. Je zaujímavé, že nález samotnej vDNA, ktorý bol spočiatku bez dysplázie, viedol k ťažkej dysplázii iba s pravdepodobnosťou 7 %.

Obrázok č. 8: Konvenčná cytológia – neprehľadný náter
Obrázok č. 9: LBC dlaždicové a endocervikálne bunky na čistom pozadí

Vidíme teda, že vyšetrenie na prítomnosť HPV DNA (respektíve na HR-HPV DNA) na strane jednej a cytologické vyšetrenie na strane druhej predstavujú dva základné, hoci metodicky odlišné testy, ktoré treba hodnotiť vo vzájomnej spojitosti. Kombinácia cytologického nálezu LSIL s prítomnosťou HPV DNA predstavuje omnoho väčšie riziko prechodu do stupňa HSIL ako nález LSIL, ktorý nie je kombinovaný s prítomnosťou HPV DNA. Rovnako i dôkaz HPV DNA bez určenia cytologického obrazu má menšiu výpovednú hodnotu, lebo infekcia HPV sa môže spontánne vyhojiť.

LBC – Liquid Based Cytology – tenkovrstvová cytológia

Tenkovrstvová cytológia (LBC) sa začala vo svete využívať od polovice 90. rokov minulého storočia a bola vyvinutá s cieľom minimalizovať nedostatky, ktoré sú spojené s konvenčnou cytológiou. Zároveň bola dôležitým krokom vo vývoji systému pre počítačom asistovaný skríning.

Výhody LBC

  • Nová technológia LBC znižuje výskyt nereprezentatívnych sterov, umožňuje presnejšie vyšetriť bunky na čistom pozadí na rozdiel od náteru v konvenčnej cytológii, ktorý býva často menej prehľadný z dôvodu hustého náteru, prekrytia buniek hlienom, bunkami zápalu, krvou, prípadne je nehodnotiteľný z dôvodu zlej fixácie (obr. 7, obr. 8).
  • Pacientky sa nemusia podrobovať opakovanému vyšetreniu u gynekológa, stačí jeden odber (tzv. 1 vialka), ktorý je možné využiť na ďalšie molekulárne genetické vyšetrenia (dôkaz a typizácia HPV, dôkaz chlamýdií, Neisseria gonorrhoeae a i.), uplatniť imunocytochemickú metodiku na detekciu onkoproteínov, a tak stanoviť aj prognózu progresie ochorenia (vysvetlené vyššie).
  • LBC zvyšuje senzitivitu a špecifickosť stanovenia.
  • LBC znižuje počet falošne negatívnych výsledkov. Uvádza sa, že až 2/3 falošne negatívnych výsledkov v konvenčnej cytológii spôsobuje zlá technika odberu a zlá fixácia, na 1/3 sa podieľajú chyby v skríningu v laboratóriu.
  • LBC umožňuje realizovať počítačom asistovaný skríning. Systém sa volá Thin Prep-Imaging-System (TIS), ktorého princípom je denzitometrická analýza jadra. LBC bolo nutným krokom vo vývoji systému, pretože hustota a prekrývanie buniek v konvenčnom cytologickom stere znamenalo problém pri meraní optickej denzity. To a následné molekulárne genetické vyšetrenia boli hlavným dôvodom vzniku tejto metodiky. Štúdiá a vývoj v tomto smere pokračujú v USA a v Európe.

Nevýhody LBC

  • Finančná náročnosť.
  • Vyšetrenie nie je hradené poisťovňou.
  • Menší počet buniek v 1 preparáte – analýza asi 50 000 až 75 000 buniek (je možné a často aj nevyhnutné zhotoviť ďalšie preparáty), zatiaľ čo v konvenčnej cytológii je v nátere prítomných 50 000 až 300 000 buniek a viac.
  • Zvýšený počet falošne pozitívnych nálezov.
  • Časovo náročné spracovanie.

Systémy na spracovanie vzorky

Podľa toho, akým spôsobom sa nanesú bunky z vialky na sklíčko, existujú 2 systémy:

  • ThinPrep, ktorý využíva filtráciu s využitím podtlaku a rotácie,
  • Surepath, ktorý využíva gravitačnú sedimentáciu.

Použitím oboch systémov sa separujú bunky od hlienu, krvi, zápalových elementov a koncentrujú sa na sklíčko na okrúhlu plochu s priemerom 20 mm pri ThinPrep alebo 13 mm pri SurePath. Separáciu riadi procesor. Preparát sa ďalej farbí rovnako ako pri konvenčnom nátere alebo sa použije na imunocytochemické farbenie a záchyt biomarkerov (p16, Ki67 a pod.). Validitu systému ThinPrep potvrdil a schválil americký Úrad pre potraviny a lieky (FDA) v roku 1996 a odporučil ako alternatívu ku konvenčnému steru. Bolo dokázané, že tento systém je signifikantne efektívnejší pre detekciu LGSIL a HGSIL lézií pri automatizovanom skríningu (TIS) než konvenčný cytologický ster.

Porovnanie LBC a konvenčného PAP steru

Pri hodnotení preparátov spracovaných metódou LBC je nutné mať na zreteli, že hodnotíme bunky v „trojrozmernom“ a nie v „dvojrozmernom“ priestore, čo je dané predovšetkým charakterom separácie a spracovania odobratej vzorky. Bunky tak majú iný charakter vzhľadu ako v konvenčnej cytológii. Je to dané predovšetkým zmazaním jasne definovaných kontúr jadra a nukleo-cytoplazmovým pomerom, ktorý často – prevažne v léziách typu low grade (LG) – nie je až taký výrazný. Taktiež je potrebné zdôrazniť, že klesá počet atypických buniek v nátere, čo je dané aj menšou plochou zhotoveného náteru, ale aj náhodným odberom buniek zo sedimentu. Cytológ tak hodnotí len náhodne vybratú vzorku, čím klesá aj počet prítomných atypických elementov v nátere. Pri opakovaných náteroch sa obrazy často značne líšia s vysokou variabilitou prítomnosti atypických buniek v jednotlivých náteroch.

Kritériá pre HSIL v LBC

Najdôležitejším kritériom je prítomnosť asymetrických trojrozmerných (trojdimenzionálnych, 3-D) štruktúr jadrových abnormalít. Je ich možné zistiť pri postupnom ostrení obrazu na jadro. 3-D jadrové abnormality je potrebné odlíšiť od jednotlivých nepravidelných jadrových ohraničení – často v benígnych bunkách LBC.

Druhým dôležitým kritériom pre HSIL je abnormálny nukleo-cytoplazmový (N/C) pomer.

Biomarkery v imunocytochémii

V imunocytochémii sa najčastejšie využívajú nasledujúce biomarkery:

–  antigén p16/INK 4 je proteín s funkciou inhibítora cyklín-dependentných kináz 4/6 (CDK 4/6), a tak za normálnych okolností brzdí bunkový cyklus; pri transformácii buniek prostredníctvom tzv. vysokorizikových typov HPV sa tento antigén paradoxne vytvára vo veľkom množstve, čo sa dá imunocytochemicky dokázať (porovnaj odsek biopsia); sporadická imunoreaktivita p16 však môže byť prítomná v metaplastických (nie dysplastických) bunkách, zápalových bunkách, systematickejšie aj v endometriálnych; kým pri bioptickom vyšetrení je farbenie na antigén p16 veľmi užitočným ukazovateľom dysplázie celej suprabazálnej vrstvy epitelu čapíka (pozri odsek biopsia), v oddelených bunkách náterov toto farbenie nedáva dostatočne spoľahlivé výsledky,

–  HPV L1 je kapsidový proteín, ktorý vyvoláva imunitnú odpoveď proti infikovaným epiteliálnym bunkám. Exprimuje sa v skorej – produktívnej – fáze HPV infekcie, ale progresívne sa stráca počas cervikálnej karcinogenézy; môže slúžiť ako prognostický marker v kombinácii s p16 a Ki-67 na odlíšenie medzi pacientkami, u ktorých lézia progreduje alebo regreduje – v prípade nejasného morfologického vyšetrenia; je to pomoc pri rozhodovaní a manažmente pacientky; L1 pozitívne prípady u vysokorizikových typov HPV pozitívnych žien s ľahkou alebo strednou dyspláziou ukazujú nízky malígny potenciál,

–  Ki-67 (MIB-1 clone) je nukleárny proteín prítomný v aktívnych fázach bunkového cyklu (G1, S, G2, mitotická fáza), zatiaľ čo v pokojovej fáze cyklu (G0) chýba; je to proliferačný marker, indikátor syntézy bunkovej DNA; expresia Ki-67 sa vyskytuje normálne v bazálnych a parabazálnych epiteliálnych bunkách, ale ak je zistená mimo týchto nižších vrstiev, je objektívnym indikátorom neoplázie; v cytologickom preparáte pozorujeme expresiu Ki-67 pri včasnej metaplázii, v zápalových bunkách a v bazálnych bunkách len vtedy, ak je „zotretý“ celistvý fragment sliznice; v cytologickom obraze bola dokázaná signifikantná korelácia medzi prítomnosťou alebo intenzitou expresie Ki-67 a závažnosťou cytologických abnormalít; Ki-67 sa využíva na bezpečné rozlíšenie fyziologickej a patologickej expresie p16 pri duálnom farbení – pozitívny výsledok oboch markerov (p16 a Ki-67) v jednej bunke znamená pozitivitu testu; Ki-67 tak umožňuje presnejšie stanovenie tzv. high grade (HG) lézií; detekcia Ki-67 slúži ako prognostický marker – umožňuje lepšie stanoviť ďalšiu liečbu pacientky, lepšie odhadnúť riziko možného vzniku nádorovej proliferácie epitelu krčka maternice – ale pri takomto kombinovanom farbení je potrebné molekulárno-genetické vyšetrenie na prítomnosť HPV najmä v prípadoch LSIL; Ki-67 považujeme za signifikantný marker vyhľadávania dysplastických buniek v náteroch spracovaných metódou LBC; preto sa dnes kombinácia minimálne 1 sklíčka farbeného štandardne a súčasne 1 sklíčka spracovaného imunocytochemicky na expresiu Ki-67 považuje za najspoľahlivejší spôsob detekcie dysplastických lézií pri spracovaní metódou LBC; treba mať však vždy na zreteli fakt, že fyziologická proliferácia v náteroch nikdy neabsentuje, takže základné morfologické kritériá (pomer N/C) sú rozhodujúce, najmä ak je imunohistochemický nález pozitívny v zreteľne dysplastických elementoch.

 

AUTOPROTILÁTKY A PORUCHY PLODNOSTI

Organizácia spojených národov ešte v 20. storočí verejne deklarovala základné právo rodiny mať deti v takom počte, ako to konkrétna rodina považuje za najvhodnejšie. Žiaľ, v posledných rokoch stúpa každoročne počet bezdetných párov. Poznanie a riešenie početných príčin neplodnosti (u žien aj u mužov) preto predstavuje výzvu súčasnosti. Známou kategóriou sú aj poruchy plodnosti (infertilita) na imunitnom podklade, ktoré sa taktiež týkajú žien aj mužov.

Protilátky proti spermiám

U oboch pohlaví môžu byť prítomné autoprotilátky, ktoré reagujú so spermiami (ASA, antisperm antibodies). Antigény spermií reagujúce s autoprotilátkami môžu mať rozličnú lokalizáciu (hlavička, krčok alebo bičík spermie), čo predurčuje aj mechanizmus ich pôsobenia. Odlišná lokalizácia autoantigénov v hlavičke, v tele alebo v bičíku spermií býva príčinou rozdielnych morfologických obrazov, ktoré pozorujeme v náteroch spermií opracovaných testovaným sérom a príslušnou označenou protilátkou (metóda nepriamej imunofluorescencie, nIF). Bol identifikovaný napríklad polypeptid lokalizovaný v axonéme bičíkov spermií, zvaný radiálny lúčový (radial spike) proteín (pôvodne meichroacidín). Ten je príbuzný s polypeptidom prítomným v analogickej štruktúre kinocílií. Povrchová úprava – tzv. „kapacitácia“ – spermií nastáva už v ampule vajcovodu a prebieha v časovej synchronizácii s termínom ovulácie. Receptory v oblasti ZP vaječnej bunky (zona pellucida, blana obaľujúca oocyt) sú najmenej dva (ZP2 a ZP3). Tie umožnia adsorbciu (priľnutie) ako aj penetráciu spermie do oocytu. Z povrchu spermií sa najprv (pri kapacitácii) odstránia niektoré labilne viazané ochranné glykoproteíny pochádzajúce z epididymis. V membráne spermie zostáva pevne naviazaný sialoglykoproteín (gp20), ktorý je ukotvený do jej vnútornej lamely. Gp20 reaguje s receptorom ZP2 oocytu. Nedávno bol u myší identifikovaný dominantný antigénový epitop (YLP12 skratka pre YLPVGGLRRIGG 12-mer), súčasť dlhšieho polypeptidu 50kDa, ktorý hrá úlohu kofaktora pri interakcii spermie s receptorom ZP2. Na tejto interakcii sa okrem toho podieľajú kyslé mukopolysacharidy ZP a alkalické radikály molekuly akrozínu pochádzajúceho z akrozómovej vezikuly. Interakcia spermie a ZP2 vaječnej bunky s väzbovým miestom príslušného akrozómového proteínu totiž spúšťa aktiváciu obsahu akrozómovej vezikuly (akrozómová reakcia, AR), pri ktorej sa pro-akrozín mení na akrozín (Acr). Prenos aktivačného signálu pri AR nastáva pomocou indukčnej molekuly FA-1 (fertilizačný antigén 1), čo je glykoproteín prítomný v oblasti stredného oddielu bičíka aj v stene akrozómového vačku. Jeho externá doména obsahuje receptor pre interakciu so ZP oocytu, kým vnútorná doména má motív pozostávajúci z aminokyslin serínu a treonínu, ktoré sa fosforylujú v priebehu adsorbcie hlavičky spermie. FA 1 (fertilizačný antigén 1) je teda signálna molekula pre uvoľnenie i aktiváciu početných enzýmov prítomných v inaktívnej forme v akrozómovom vačku. Proteín PH-20, pôvodne identifikovaný v akrozómoch pomocou protilátky, ktorá bráni adsorbcii hlavičky spermie na ZP, má sekvenciu (doménu) podobnú hadiemu jedu s výraznou aktivitou hyaluronidázy. Spolu s ďalšou hyaluronidázou (Hyal-5), tiež prítomnou v akrozómoch, sa oba enzýmy podieľajú na prieniku spermií cez zvyšky medzibunkového tmelu (cumulus mass) vo vrstve drobných buniek (granulárne bunky), ktoré pochádzajú z Graafovho folikulu a sú bohaté na kyselinu hyalurónovú. Laktátdehydrogenáza (LDH) a galaktozyltransferáza (Gal-T) sú ďalšie enzýmové aktivity asociované s obsahom akrozómovej vezikuly. Gal-T sa považuje za molekulu ZP3R, ktorá by mohla byť receptorom pre ZP3 (na povrchu oocytu). Interakcia ZP3/ZP3R spúšťa proces fúzie medzi membránou spermie a oocytom (kortikálna reakcia), čoho výsledkom je oscilácia hladiny Ca2+ v oplodnenej vaječnej bunke. Pri interakcii spermie s membránou oocytu bol identifikovaný aj integrín (na povrchu vaječnej bunky), ktorý reaguje s molekulou označovanou ako fertilín na povrchu hlavičky spermie. Interakcia integrín/fertilín napomáha dokončeniu fúzie oboch membrán.

Ako vyplýva z uvedeného textu, rozliční autori opísali vyše 10 funkčne významných a súčasne antigénovo účinných bielkovín a glykoproteínov, ktoré predstavujú imunogény (antigény) pre tvorbu autoprotilátok blokujúcich oplodnenie vaječnej bunky. Ak k interakcii spermií s autoprotilátkou dochádza vo vagíne, Fc fragment molekúl Ig pokrývajúci spermiu reaguje so sacharidovou zložkou glykoproteínov v endocervikálnom kanáli, čo výrazne bráni ďalšiemu pohybu spermií. Autoprotilátky u ženy teda blokujú počatie aj v neprítomnosti autoprotilátok u jej pohlavného partnera. Na druhej strane však autoprotilátky môžu byť prítomné aj v ejakuláte, takže príčinou neplodnosti ženy je v takomto prípade sexuálny partner, čoho dôkazom môže byť skutočnosť, že žena otehotnie s iným mužom. Na dôkaz prítomnosti kvality spermií, respektíve na testovanie autoprotilátok naviazaných na spermie už v samotnom ejakuláte sa používajú viaceré testy. Klasický test, tzv.hypoosmotický test (HOS test) meria schopnosť spermií reagovať na hypoosmotické prostredie napučaním a vystretím vlastnej membrány. Zhora opísaný tyrozínkinázový signálny systém aktivuje vo vnútri hlavičky spermie už po naviazaní autoprotilátky. V dôsledku toho dochádza k zmene jej osmolarity a k úniku cholesterolu spevňujúceho bunkovú stenu. Po väzbe ASA na terčové autoantigény hlavičky spermií je schopnosť odolať osmotickému šoku znížená, čo možno vyjadriť stupnicou HOS testu. Iným testom je zhlukovací aglutinačný test (agglutination test). a jeho modifikácie. Zhlukovanie spermií s naviazanou autoprotilátkou nastáva pomocou plastických „perál“ pokrytých anti-Ig protilátkami (immunobead agglutination test). Test potom určuje percentuálny podiel spermií, ktoré sú pokryté ASA, a preto viažu uvedené guľôčky.

Obrázok č. 10: Pozitívna fluorescencia spermií pri, ktorej autoprotilátky reagujú s membránou hlavičky ako aj s bičíkmi (vidno celé bunky).

Mechanizmus miestnej tvorby autoprotilátok proti spermiám (ASA) súvisí, ak neuvažujeme o lokálnom úraze, najmä s nehnisavou chronickou infekciou prostaty chlamýdiami, respektíve podobnou infekciou pohlavných ciest u žien (nehnisavá kolpitída alebo adnexitída). Tieto stavy sú súhrnne označované ako syndróm chronických bolestí panvy (chronic pelvic pain syndrome, CPPS). Nespôsobujú síce mechanickú prekážku pre pohyb spermií, ale navodia tvorbu autoprotilátok (ASA), ktorá môžu byť rovnako vážnou prekážkou oplodnenia. ASA sa tvoria na princípe napodobnenia antigénu (antigenic mimicry). Takéto cudzorodé antigény môžu svojou čiastočnou zhodou „pomýliť“ receptory pamäťových B buniek natoľko, že začnú tvoriť autoprotilátky. V ejakuláte sú pravidelne prítomné látky potláčajúce imunitnú reakciu. Ale ich ochranné pôsobenie býva prekonané v dôsledku provokujúcich udalostí, ako sú úrazy alebo infekcie. Predpokladá sa, že antigény Ch. trachomatis sú rozpoznávané aj miestnymi Th lymfocytmi, ktoré neprešli selekciou v týmuse, takže sú schopné rozpoznať nielen cudzorodé, ale aj telu vlastné antigény. Indikátorom aktivácie takýchto lokálnych Tγδ cell lymfocytov v ejakuláte je proteín hsp60 (heat shock protein, 60kDa, proteín teplotného šoku).

Obrázok č. 11: Pozitívna fluorescencia hlavičiek spermií (bičíky negatívne)

Vyšetrenie ejakulátu pre chúlostivý spôsob odberu môže byť pre muža psychickou záťažou. Naproti tomu IF test v sére (viď. Obrázok č. 10 a Obrázok č. 11) je výhodný pre oboch partnerov aj z iných hľadísk: je rýchly, je prvým stupňom diagnostiky (skríning), je technicky nenáročný a komerčne ľahko dostupný. Ako orientačný test je metódou prvej voľby a neobťažuje žiadneho z partnerov.

Tabuľka č. 2: Štatistické výsledky vyšetrenia ASA z archívu Patológia, s. r. o., v Martine

Protilátky proti štruktúram placenty (proti trofoblastu)

Ide o pilotné stanovenie prítomnosti autoprotilátok u gravidných žien s anamnézou spontánneho potratu alebo pri autoimunitných ochoreniach s možnosťou poškodenia plodu.

Imunitná reakcia zo strany plodu proti syncyciálnym bunkám trofoblastu (SCT) placenty býva spojená s opakovanými spontánnymi potratmi charakterizovanými tvorbou protilátok proti jeho povrchovým antigénom. SCT nemá klasické molekuly HLA (iba HLA-G), ale jeho toll-like receptory rozpoznávajú imunogénne molekulové vzory (napr. lipopolysacharidy) infekčných agensov matky. Preto sa môžu autoprotilátky proti antigénom fetálnych buniek, ktoré prenikajú medzi špirálovité artérie placenty a vytvoria uteroplacentálny cievny systém, tvoriť aj mechanizmom skríženej reakcie. Presný výpočet jednotlivých terčových molekúl SCT nie je celkom známy, avšak početné antigénové epitopy boli identifikované pomocou bunkových línií derivovaných z choriokarcinómu (napr. bunky JEG-3, ktoré reagujú s autoprotilátkami matky pri metóde nepriamej IF). Medzi najznámejšie autoantigény SCT patrí ceramid hepta-dekasacharid, ktorý je prítomný aj v membráne erytrocytov umbilikálnej krvi (pôvodne aglutinačná reakcia). Okrem autoprotilátok voči povrchovým antigénom trofoblastu sa do stien cievneho systému placenty ukladajú imunokomplexy obsahujúce antifosfolipidové protilátky alebo protilátky ANA či anti-dsDNA protilátky (pri SLE u matky). Uvedené procesy vedú k deciduálnej vaskulopatii a trombóze s poškodením klkov placenty viditeľnom pri histologickom vyšetrení. Protilátky ANA (najmä SSA/Ro-52) vyvolajú poškodenie prevodového systému srdca plodu, čo spôsobuje kongenitálne poruchy srdcového rytmu a zastavenie srdca (congenital heart block).

Vyšetrenia týchto autoprotilátok je užitočné hlavne vtedy, ak je v anamnéze spontánny potrat (predčasné ukončenie gravidity na autoimunitnom základe), pri preeklampsii, pri prítomnosti autoprotilátok u matky (ANA, antifosfolipidové protilátky, protilátky proti angiotenzínovému receptoru AT1-AA, protilátky proti kardiolipínu, aCL a iné), respektíve cytokínov v krvi (najmä TNF-alfa)

Protilátky proti štruktúram ovária

Prvotné poruchy menštruácie sú dôvodom na testovanie autoprotilátok proti štruktúram (folikulom) ovária, ktoré sa dajú detegovať metódou nepriamej imunofluorescenie. Väčšina autorov nachádza významnú koreláciu medzi poruchami menštruácie u žien a prítomnosťou autoprotilátok proti bunkám folikulov ovárií, potvrdzujúc autoimunitný pôvod takejto dysfunkcie. Prvotná nedostatočnosť vaječníkov (POI, primary ovarian insufficiency) je amenorea spojená s hypogonadizmom, ktorá sa vyvíja u žien pred 40. rokom života. Popri primárnych a sekundárnych folikuloch pozorujeme veľa rastúcich antrálnych folikulov s diferencujúcimi sa bunkami theca folliculi interna a externa, ktoré však nedozrievajú do výsledných Graafových folikulov. V stróme sa nachádza výrazný infiltrát zložený z T-lymfocytov. Protilátky reagujú najmä s bunkami theca ovarii (interna alebo externa), čomu napomáha pôsobenie cytotoxických T-lymfocytov. Základným nálezom je pribúdanie nezrelých folikulov v kôre ovária s poškodením tekálnych buniek, respektíve ich selektívnou deštrukciou (pri zachovaní granulózových buniek). Poškodenie buniek folikulov vyvoláva následnú cystickú premenu ovárií. V prípade pozitívneho výsledku IF testu sa odporúča vyšetriť krvné hladiny FSH a LH (napr. metódou ELISA), pretože klesá hladina estradiolu, ale stúpa hladina FSH (kompenzácia sekrécie steroidov).

ZÁVER

Tak ako v iných odboroch laboratórnej diagnostiky, aj v patológii je v súčasnosti zreteľný trend prieniku nových metód, predovšetkým z oblasti molekulárnej patológie či imunopatológie. Široké portfólio a vzájomné dopĺňanie či prelínanie týchto metód dáva klinickému lekárovi nielen väčšiu záruku správnej diagnostiky, ale presná diagnostika poskytuje aj vyššiu spoľahlivosť predikcie vývoja ochorenia u pacienta. Je dôležité si uvedomiť, že komplexnosť ponuky Alpha medical je pre lekára príležitosťou, ako stanoviť diagnózu pacienta naprieč týmto spektrom vyšetrení v priebehu niekoľkých dní. Na nastavenie vhodnej liečby je však potrebné porozumenie postupu a podmienkam, za akých patológ pristupuje k stanoveniu výsledku vyšetrení. Všetci naši spolupracujúci lekári majú možnosť tieto závery po obdŕžaní výsledkov konzultovať s lekárom laboratória, aby tak bola v kooperácii patológa s klinickým lekárom zabezpečená správna interpretácia výsledkov a navrhnutá optimálna liečba pacienta. Tento text sledoval práve tento cieľ. Veríme, že sa nám podarilo poukázať na kľúčové body súčasnej diagnostiky pracovísk patologickej anatómie Alpha medical a ozrejmiť ich dôležitosť a prínos v rutinnej praxi.

 


 

„Tieto údaje predniesli krajskí odborníci pre gynekológiu a pôrodníctvo na celoštátnej analýze gynekologických karcinómov v rámci Liptovského dňa gynekologickej onkológie, ktorý sa konal 9. 11. 2013 v Kúpeľoch Lúčky pri Ružomberku. Ide o počty diagnostikovaných a operovaných pacientok s gynekologickými malignómami. Cieľom týchto analýz, ktoré vykonávame jedenkrát ročne, je zabezpečenie centralizácie operačnej liečby v onkogynekologických centrách. Takéto centrá by mali spĺňať odborné kritériá a za vykázané výkony by im mala byť zo strany zdravotných poisťovní poskytnutá primeraná platba. Onkogynekologické výkony by tak boli vykonávané so zárukou maximálnej medicínskej odbornosti a zároveň ekonomicky efektívne,“ komentuje súčasnú situáciu prof. MUDr. Miloš Mlynček, ktorý poskytol údaje k Mape operovaných a diagnostikovaných gynekologických karcinómov 2013.

Hodnotenie článku

doc. MUDr. Július Rajčáni, DrSc.

Spoluautor

Patológia, s. r. o., Martin

Zobraziť všetky články

MUDr. Jozef Bodnár

Spoluautor

manažér Diagnostického centra patológie Alpha medical v Košiciach a odborný zástupca

Zobraziť všetky články

prof. MUDr. Marian Adamkov, CSc.

Spoluautor

Patológia, s. r. o., Martin

Zobraziť všetky články

Drahuša Glashutnerová

Spoluautor

HIS – DG, s. r. o., Košice

Zobraziť všetky články

Ľubomíra Hicárová

Spoluautor

HIS – DG, s. r. o., Košice

Zobraziť všetky články

Dipl. Biol. Katarína Baluchová, PhD.

Spoluautor

Histopatologia, a. s., Bratislava

Zobraziť všetky články

inVitro 3/2014

Gynekológia a pôrodníctvo

Tento článok sa nachádza v čísle InVitro 3/2014 Gynekológia a pôrodníctvo. Ak máte záujem o časopis v tlačenej verzii, ozvite sa nám.
Objednať inVitro